差异表达克隆格瑞菲斯瓦尔德磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)MSR-1磁小体合成相关基因

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目的:控制菌体生长过程中的氧分压,筛选获得产磁小体菌株的最适条件。选择最适方法获取总RNA,通过mRNA差异显示技术,克隆不同氧分压下,格瑞菲斯瓦尔磁螺菌(M.gryphiswaldense)MSR-1磁小体合成相关基因。  方法:将格瑞菲斯瓦尔磁螺菌(M.gryphiswaldense)MSR-1的液体培养和固体平板计数法建立对应关系,得出每个OD600含有的活菌数;通过控制同容积中不同培养基的量,筛选菌体最适培养量;比较不同方法提取格瑞菲斯瓦尔磁螺菌(M.gryphiswaldense)MSR-1RNA,选择TaKaraRNAisoPlus试剂盒法提取RNA;设计、选择随机引物,将验证后的不同引物组合应用于mRNA差异显示技术中;通过BLAST比对及生物学软件,对差异片段的序列特征、结构特点等进行分析和预测。  结果:1、建立了磁螺菌(M.gryphiswaldense)MSR-1的液体培养和固体平板计数法对应关系,得出每个OD600对应的活菌数,为以后的实验提供较便捷的方法和准确的数据。  2、通过控制同容积中不同培养基的量,以此比较磁小体合成情况,筛选获得了产磁小体菌株和不产磁小体菌株的最适培养基量约分别为40%和10%。  3、比较RNA提取的不同方法,结果显示RNAisoPlus试剂盒中其特殊成分能选择性的与RNA结合,能更有效地清除DNA及蛋白质污染,提取的RNA纯度、质量较高。  4、通过mRNA差异显示技术克隆基因,共获得2条有效差异片段。差异片段P-1中ORF3读码框编码186个氨基酸,其编码的蛋白与Ralstoniasolanacearum的保守结构域PvdE的同源性为42%(56/132)。PvdE为它是一个ABC型嗜铁素运输系统、融合ATP酶和透性酶组件,主要进行细胞内次级代谢产物生物合成、运输和催化无机离子等代谢过程;差异片段P-2中的ORF3读码框编码的68个氨基酸,与Typhulaishikariensis中长为143氨基酸的细胞色素氧化酶的同源性49%(19/39),此酶是一种内源氧代谢标记物,为有机体呼吸链的最后一个酶,可催化其底物亚铁细胞色素C,并与氧化磷酸化偶联,为细胞功能活动提供能量。
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