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研究背景和目的骨组织是一种以其固有的自愈潜力而闻名的动态重塑组织,然而,当骨缺损尺寸大于临界尺寸时,这种复杂组织独特的自愈能力和再生能力会显着下降。特别是源于外伤或退行性疾病,如口腔颌面部的肿瘤或创伤引起的大面积颌骨缺损,是无法通过自愈能力进行骨缺损修复。临床修复当中,自体骨取材受到的形态、数量、体积受限,且移植后容易出现明显的骨吸收。加工的异体骨移植可能引发机体免疫排斥反应,同时成骨能力有限,因此,对有助于促进大块骨缺损愈合的再生骨移植物存在相当大的需求。骨组织独特的生理特性是临床中开发模拟天然骨骼合成替代品的最突出挑战。近几十年来大量的临床研究都是为了满足理想的促进骨骼生长治疗策略的巨大需求。生物活性聚合物支架通过为细胞附着、增殖提供适宜的微环境,随后支架缓慢降解以促进新骨形成,在骨组织工程中发挥着核心作用。然而,在探索各种可用的聚合物及无机生物材料时,其中大多数失败是由于不能满足以下条件,例如骨移植物不符合抗压强度要求,没有或不良的骨诱导能力等。骨组织工程最有前途的方法是基于干细胞的治疗策略,其中间充质干细胞的自我更新能力和分化能力促进更快的新骨形成,干细胞嵌入可生物降解支架的组合方法是一种有效的组织工程结构。牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）最初用酶消法从牙髓中获得,并且表达多种干细胞表面标记物。研究证明此类细胞的群体倍增时间较短。在过去的10年中,DPSCs由于其自我更新和向多种细胞表型分化的能力而在组织工程和再生医学领域受到广泛关注。有研究表明DPSCs 比骨髓干细胞（bone marrow stem cells,BMSCs）的克隆和增殖性能更强。因此,DPSCs是骨组织工程中潜在且理想的细胞来源。然而,DPSCs是成体干细胞,具有有限的增殖和分化潜能。为了满足骨组织工程的需要,必须尽可能提高DPSCs的增殖和成骨分化的能力。目前可以促进干细胞的分化和成骨的常用方法有基因转染、成骨相关因子、中草药提取的具有生物活性的小分子化合物。此外,某些生物材料也具有良好的促进干细胞成骨和分化的效果。从中草药中进行小分子生物活性成分的分离和鉴定开辟了再生医学及组织工程的新示范,植物化学物质具有成本低、效益高、副作用小、治愈能力强等优点在世界范围内受到极大的关注。因此,鉴定有效且经济的中草药来源的小分子化合物以诱导DPSCs的增殖和分化是骨组织工程中的紧迫任务。白杨素（chrysin）是一种天然黄酮类化合物,存在于各种植物和食物中,如西番莲、洋甘菊、蜂胶和蜂蜜。很多研究表明类黄酮类小分子化合物,包括槲皮素、淫羊藿等可诱导间充质干细胞分化。有学者的研究发现,白杨素通过优先激活ERK1/2可诱导前成骨细胞MC3T3-E1成骨分化。因此,研究证明白杨素具有通过促进成骨细胞分化预防和治疗骨质疏松症的巨大潜力。然而,白杨素对DPSCs的增殖和分化的影响仍不清楚。蛋白质组学已成为生物学研究的基础领域,被认为是发现药物靶标的关键工具。蛋白质组学采用大量精密的数据分析手段具有许多优势,因为它可以比基因水平分析更直接地描述分子反应。因此,蛋白质组学分析和相关蛋白的差异表达分析可能有助于阐明白杨素诱导DPSCs成骨的潜在机制。本研究培养及筛选了比较纯化的DPSCs,通过体外、体内实验研究白杨素对DPSCs的增殖、成骨分化能力的影响,通过蛋白质组学的分析,探讨白杨素影响DPSCs成骨分化的机制,为骨组织工程中白杨素应用提供理论基础。研究方法1.牙髓干细胞的体外分离培养和鉴定用组织块联合酶消化法处理第三磨牙牙髓组织（18～22周岁年轻患者）,培养原代牙髓细胞。检测细胞克隆形成能力。通过流式细胞术检测细胞表面标记物CD73、CD44、CD90、CD105、CD34和CD45的表达情况。将细胞分别进行成骨向诱导、成脂向诱导及成软骨向诱导,鉴定其多向分化潜能。2.白杨素对牙髓干细胞增殖及成骨分化的影响（1）用含白杨素0、10-6、10-5、10-4、10-3和10-2mmol/L浓度的完全培养液培养人牙髓干细胞1～5d,利用细胞增殖-毒性检测试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）检测不同时间点（1d、2d、3d、4d、5d）白杨素对DPSCs增殖能力的影响。用含以上不同浓度白杨素的矿化诱导液诱导DPSCs 7d,检测各组碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性。继续使用含以上不同浓度白杨素的矿化诱导液诱导DPSCs 14d,选用茜素红染色来评价各组细胞钙基质的矿化程度,利用实时荧光定量聚合酶链反应（quantity real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测 DPSCs成骨相关基因 ALP、Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ,Colla Ⅰ）、Runt 相关转录因 2（runt-related transcription factor 2,Runx2）和骨钙素（osteocalcin,OCN）的 mRNA 表达水平的表达水平。筛选出白杨素的最适浓度（10-5 mmol/L）。（2）为进一步证实白杨素促进DPSCs成骨分化能力增强。实验分为两组:对照组为成骨培养基,实验组选择白杨素成骨培养基,在其他参数同样条件下对两组干细胞进行7d、14d和21d的成骨诱导,选用茜素红染色来评价各组细胞钙基质的矿化程度。利用qRT-PCR技术检测各组细胞成骨的相关基因ALP、Colla Ⅰ、Runx2、OCN的mRNA表达水平。利用蛋白免疫印迹（Western blots）技术检测各组细胞成骨分化相关蛋白ALP、Runx2、骨桥蛋白（osteopontin,OPN）的表达水平。从而进一步分析白杨素对DPSCs成骨分化潜能的影响。3.白杨素诱导牙髓干细胞体内成骨能力（1）本实验在裸鼠皮下建立了异位成骨模型。支架材料选用厚度2 mm,直径5mm,75%孔隙率的β-磷酸三钙（β-tricalcium phosphate,β-TCP）。实验随机分为3组:第 1组（n=8）,β-TCP;第 2组（n=8）,β-TCP+DPSCs;第 3 组（n=8）,β-TCP+DPSCs+Chrysin。DPSCs分别在常规成骨诱导液和含白杨素（10-5 mmol/L）的成骨培养基中诱导10d,然后与β-TCP混合。所有标本移植到8w龄的裸鼠的背部皮下,手术植入后12w收集所有样品,进行苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining,HE）染色及Masson染色。（2）本实验在大鼠颅骨建立原位成骨模型。选取8w龄的雄性SD大鼠16只。在每个大鼠颅骨的顶骨上形成了两个对称的全厚度临界颅骨缺损（直径5mm）。将32例颅骨缺损随机分为4组:第1组（n=8）,Blank;第2组（n=8）,β-TCP;第3组（n=8）,β-TCP+DPSCs;第 4组（n=8）,β-TCP+DPSCs+Chrysin。DPSCs分别在常规成骨诱导液和含白杨素（10-5 mmol/L）的成骨培养基中诱导10d,然后与β-TCP混合,术后12w收集大鼠颅骨标本。进行微计算机断层扫描技术（micro computed tomography,Micro-CT）扫描及 HE 染色。4.白杨素促进牙髓干细胞成骨分化相关蛋白组学分析（1）A、B、C分别来自三个不同个体的DPSCs样本。A0、B0、C0为对照组:DPSCs;A1、B1、C1为实验组:Chrysin+DPSCs。两组样本分别成骨诱导10d后将标本送入复旦大学人类表型组研究院蛋白质组平台。为了探索实验组和对照组的DPSCs之间差异表达的蛋白质,我们通过液相色谱质谱联用技术（liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS/MS）进行了蛋白质组学分析。本课题鉴定了 6 个样本的蛋白质数量,并进一步比较A、B、C三组实验组与对照组上下调均在两倍以上的差异蛋白。将差异表达蛋白进行了基因本体分析（Gene Ontology analysis,GO分析）及差异性蛋白的交互作用分析。其中与成骨相关的Smad3蛋白富集升高的最多。（2）为了进一步探讨白杨素处理的DPSCs中Smad3表达和活性的变化,我们采用Western blot检测方法,对白杨素作用DPSCs不同时间点Omin、15min、30min、60min、120min蛋白Smad3、P-Smad3的表达进行了检测。为了确定Smad3激活是否促进了白杨素素介导的DPSCs的成骨分化,我们评估了 Smad3磷酸化抑制剂（SIS3）对DPSCs的成骨分化的影响。选用茜素红染色来评价各组细胞钙基质的矿化程度。利用qRT-PCR技术检测各组细胞成骨相关基因ALP、Collagen Ⅰ、Runx2、OCN的mRNA表达水平。利用Western blot检测各组蛋白Smad3、P-Smad3的表达。研究结果1.牙髓干细胞的体外分离培养和鉴定新鲜牙髓组织经组织块联合酶消法体外培养7d～10d左右可见大量原代细胞从组织块周围爬出,融合度80%,细胞形态多为成纤维样细胞,标准长梭形态,胞体饱满,细胞呈现出有规则的方向性排列。细胞核呈典型卵圆形,由2～3个核仁组成。核仁清楚,位于细胞的中央。通过流式细胞术检测发现DPSCs高表达间充质干细胞表面标记物 CD73、CD44、CD90、CD105,阳性率分别为 99.92%、99.98%、99.97%、99.71%,不表达造血干细胞表面标记物CD45和CD34。DPSCs成骨诱导21d茜素红染色,肉眼观察可见成骨诱导组矿化结节染色为红色,而对照组无色。DPSCs成脂诱导28d油红O染色,显微镜下可见细胞间有明显的红色脂滴形成。DPSCs成软骨诱导28d阿利辛蓝染色,显微镜下可见蓝色的软骨样基质。2.白杨素对牙髓干细胞增殖及成骨分化的影响（1）应用CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒检测不同浓度（10-6、10-5、10-4、10-3和10-2mmol/L）白杨素对DPSCs刺激不同时间（1d、2d、3d、4d、5d）后细胞增殖的变化,结果表明各组细胞活性无统计学差异（P＞0.05）,白杨素对DPSCs增殖无明显影响且无细胞毒性作用。含不同浓度白杨素成骨诱导液培养DPSCs 7d,碱性磷酸酶活性检测结果显示DPSCs在10-5mmol/L白杨素作用下表达的ALP活性最高。含不同浓度白杨素成骨诱导液培养DPSCs 14d,茜素红染色及CPC定量结果显示,与其他浓度的白杨素相比,10-5 mmol/L白杨素诱导了最广泛的矿化结节。利用qRT-PCR检测DPSCs成骨相关基因的表达水平,结果显示在白杨素10-5 mmol/L时成骨相关基因ALP、Colla I、Runx2、OCN的mRNA表达上调最为明显。10-5 mmol/L白杨素作为后续研究的最适浓度。（2）对照组为成骨培养基,实验组为含浓度10-5 mmol/L白杨素成骨培养基,两组分别诱导DPSCs 7d、14d和21d,实验组比对照组茜素红染色加深,成骨诱导效果显著增加。Western blots技术检测成骨分化相关的代表性的蛋白表达量,白杨素上调了成骨相关蛋白如ALP、Runx2、OPN的表达。经过白杨素处理的DPSCs中,ALP、Colla1、Runx2和OCN的mRNA表达水平较对照组显著增加。然而,基因表达的增加在诱导期间的不同时间点有所不同,白杨素在诱导后7d和14d上调了成骨细胞分化早期标记物ALP和Colla1的mRNA表达,在14d到21d OCN的mRNA表达量持续增加。3.白杨素诱导牙髓干细胞体内成骨分化（1）裸鼠皮下异位成骨模型标本进行HE染色显示:β-TCP组可见支架材料孔隙清晰,稀疏纤维组织无序性排列。β-TCP+DPSCs,β-TCP+DPSCs+Chrysin纤维样类骨质形成在支架材料孔隙边缘。β-TCP+DPSCs+Chrysin组形成纤维样类骨质作用最强,显著优于β-TCP+DPSCs,可观察到更宽的类骨质形成区域。此外,Masson染色结果显示:β-TCP+DPSCs+Chrysin形成了最多的类骨质。测算新生类骨质占孔隙面积的百分比可见:β-TCP+DPSCs+Chrysin 组明显高于 β-TCP+DPSCs 组。（2）大鼠颅骨缺损模型样本进行Micro-CT扫描及HE染色。Micro-CT结果显示:Blank组的骨缺损无法修复。与β-TCP组和β-TCP+DPSCs组相比,β-TCP+DPSCs+Chrysin组表现出最丰富的类骨质形成,使该组的颅骨缺损得以完全修复,新骨的骨体积（bone volume,BV）和骨矿物质密度（bone mineral density,BMD）最高。HE 染色显示:支架材料孔隙边缘均可观察到淡粉色的新生纤维样类骨质向孔隙区中心生长,β-TCP组可见孔隙空隙较多,纤维样骨组织附着在支架边缘。β-TCP+DPSCs组可见孔隙空隙减小,纤维样类骨质稀松排列。β-TCP+DPSCs+Chrysin联用组新生类骨质将空隙占满,纤维骨量最为致密,明显高于Blank组、β-TCP组、β-TCP+DPSCs组。4.白杨素促进牙髓干细胞成骨分化相关蛋白组学分析（1）从6个样品中总共鉴定出35975个蛋白,在这些蛋白中两组表达水平变化差异超过2倍的为157个,其中上调蛋白86个,下调蛋白71个。将157个差异表达蛋白进行了 GO分析。在生物学过程（Biological Process,BP）分析中,39.8%的富集差异性蛋白质属于代谢和能量途径。在细胞组分（Cellular Component,CC）分析中,60.4%的富集差异性蛋白质属于细胞质成分。差异性蛋白的交互作用网络节点,可见蛋白Smad3显著富集升高。上述蛋白质组学分析和以往报道中的发现表明差异表达的蛋白Smad3与成骨细胞分化密切相关,推测Smad3可能参与了白杨素诱导的DPSCs的成骨分化。（2）为了进一步探讨白杨素处理的DPSCs中Smad3表达和活性的变化,我们采用Western blot检测方法,对白杨素作用DPSCs不同时间点0min、15min、30min、60min、120min蛋白Smad3、P-Smad3的表达进行了检测,结果发现白杨素以时间依赖性方式增加了 Smad3的蛋白质表达和磷酸化。Smad3磷酸化抑制剂（SIS3）的处理显著抑制了白杨素介导的DPSCs的成骨分化,茜素红染色的矿化结节明显减少,成骨分化相关的ALP、Colla1、Runx2和OCN的mRNA表达水平明显降低。Western blot检测结果显示SIS3处理后蛋白Smad3、P-Smad3的表达降低。研究结论1.本实验成功地获得了具有间充质干细胞特性的DPSCs,为后续实验提供了良好的体外细胞模型。2.适宜浓度的白杨素对DPSCs无细胞毒性作用且可以促进DPSCs成骨分化。3.白杨素作用下的DPSCs复合β-TCP应用在体内时,能够很好地促进骨缺损的修复,为临界骨缺损的治疗提供了一种新的解决方法。4.通过蛋白组学分析差异性蛋白及验证,表明白杨素通过增加Smad3的表达并促进其磷酸化,进一步增强成骨相关基因及蛋白得表达来诱导DPSCs的成骨分化。