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肌酸是一类由精氨酸、甘氨酸和腺苷甲硫氨酸构成的氨基酸衍生物,肌酸代谢可以为动物机体快速提供能量,而骨骼肌能量代谢情况对肉品质存在影响。为研究猪骨骼肌肌酸代谢及其对肉品质的影响,本论文开展了以下7个部分的试验研究。
试验一进行了猪骨骼肌肌酸转运载体cDNA的分子克隆。以猪骨骼肌总RNA为模板,通过RT-PCR和RACE技术相结合克隆得到猪骨骼肌CrTcDNA序列,全长2734bp,其中ORF长1908bp,3UTR长233bp,5UTR长233bp。基因序列分析显示猪骨骼肌CrT预测氨基酸序列与人、牛和鼠CrT的同源性均在90％以上。
试验二研究了猪骨骼肌肌酸转运载体mRNA表达的组织特异性。以Real-timeRT-PCR法检测5月龄长白猪不同组织CrT mRNA表达水平,并采用原位RT-PCR和酶组织化学法相结合进一步测定猪腰大肌CrT mRNA分布情况。结果发现猪CrTmRNA表达丰度以骨骼肌最高,显著高于肾、肺、心、肝、脑和脾脏(P＜0.05)。猪腰大肌CrTmRNA原位阳性信号主要在肌纤维细胞内表达,面积较大肌纤维内表达的阳性信号较强,且染色斑点面积与肌纤维面积呈显著正相关(P＜0.05);而猪腰大肌βR型肌纤维面积显著小于αR和αW型肌纤维(P＜0.05)。
试验三研究了日龄和品种对猪骨骼肌肌酸转运载体mRNA表达的影响。选用60、90和150日龄蓝塘猪和长白猪背最长肌为试验材料,结果发现蓝塘猪和长自猪背最长肌αW型肌纤维比例和肌纤维面积均随日龄增加而增加,与此变化相似的是,背最长肌CrT mRNA表达丰度也随日龄增加而升高。选用上市日龄长白猪、蓝塘猪和大花白猪背最长肌、斜方肌和腰大肌为试验材料,结果发现品种和骨骼肌部位对猪骨骼肌CrT mRNA表达丰度均存在显著影响(P＜0.05),蓝塘猪背最长肌CrTmRNA表达丰度低于大花白猪和长白猪,与此一致的是,蓝塘猪背最长肌肌酸含量显著低于后两种猪(P＜0.05)。
试验四研究了一水肌酸对猪生产性能和肉品质的影响。选用氟烷基因杂合子(Nn)和氟烷基因隐形纯合子(NN)猪为试验动物,持续补饲Nn猪0、25g/d/头一水肌酸(CMH)14d。结果发现氟烷基因型有改变猪骨骼肌滴水损失48h值趋势(P＜0.10)。补饲CMH显著影响Nn猪骨骼肌pH45min 和Opto-star24h值,其中显著降低了Nn猪半腱肌pH45min值以及背最长肌和半腱肌Opto-star24h值(P＜0.05)。
试验五研究了猪骨骼肌卫星细胞的分离培养及其对一水肌酸的反应。采用胶原酶消化分离7日龄仔猪半腱肌获得卫星细胞,经形态学和免疫组化以及体外增殖试验测定发现以2h差速贴壁法获得的上清细胞中的肌卫星细胞生长增殖活力较好,纯度较高。以MTT法测定CMH对骨骼肌卫星细胞增殖的影响,结果显示CMH浓度和处理时间对细胞增殖均存在显著影响,且两者存在显著交互效应。
试验六研究了一水肌酸对猪骨骼肌肌酸代谢和糖代谢的影响。通过在体试验和离体试验相结合测定CMH对猪骨骼肌肌酸代谢和糖代谢的影响,结果发现氟烷基因型显著影响骨骼肌CrT和AMPKγ1 mRNA表达丰度,Nn猪骨骼肌CrT和AMPγ1mRNA表达水平较低。持续补饲Nn猪25g/d/头CMH 14d显著影响骨骼肌肌酸、乳酸和乳酸脱氢酶活性含量以及AMPKα1 mRNA表达丰度(P＜0.05)。补饲CMH和骨骼肌部位发生交互作用显著影响骨骼肌Na+K+-ATPase-alphal mRNA表达水平(P＜0.05)。CMH处理显著影响猪成肌细胞乳酸含量。CMH浓度和处理时间对成肌细胞CrT、CKm、Na+-K+-ATPase-alphal、GLUT4和AMPKα1 mRNA表达水平均存在显著交互效应(P＜0.05)。
试验七研究了一水肌酸对猪骨骼肌肌纤维特性和抗氧化特性的影响。通过在体试验和离体试验相结合测定CMH对猪骨骼肌肌纤维特性和抗氧化特性的影响,结果发现氟烷基因型显著影响骨骼肌SOD1 mRNA表达丰度(P＜0.05),Nn猪骨骼肌表达水平较低。体外试验发现CMH浓度和处理时间对成肌细胞SOD1 mRNA表达丰度存在显著交互效应(P＜0.05)。补饲CMH与骨骼肌部位对Nn猪骨骼肌MyHCIIb比例存在显著交互效应,而体外试验发现CMH浓度和处理时间发生交互作用有改变成肌细胞MyHCI mRNA表达水平趋势。