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家禽的繁殖性状受到下丘脑--垂体--性腺轴的高度调控,在现代家禽生产中,提高产蛋量和防止家禽就巢行为是育种的重要目的。本研究通过不同的实验方法,综合的筛选与家鸡繁殖性状相关的候选基因,并选择合适的基因做为候选基因,分析该基因DNA序列的变化对鸡繁殖性状的遗传效应;mRNA的变化与繁殖性状的关系;并通过转录组测序的方法,研究影响家鸡就巢行为的遗传机制。
本试验通过消减抑制杂交的方法筛选与鸡就巢性状相关的候选基因,qPCR验证得到了3个候选基因:GARNL1、TRA@和Smad7;在就巢状态下,GARNL1基因在大脑、小脑、下丘脑和垂体等组织的mRNA表达量要高于不就巢状态;GARNL1可能是影响家鸡就巢的候选基因。
通过对宁都黄鸡高就巢低产蛋和高产蛋低就巢两组两尾样品进行全基因组关联分析,共发现有700个SNP与鸡就巢性状相关(P<0.05),与产蛋相关的位点有2802个(P<0.05)。位于5号染色体上的位点GGaluGA271632分别与就巢性状和300日龄总产蛋量性状极显著相关;对5号染色体进行单倍型块分析,由就巢相关的点构成的单倍型块有6个,由300日龄总产蛋量相关的点构成的单倍型块有28个,GARNL1基因位于其中的一个单倍型块中;537804bp~938910bp这个区域可能与鸡的就巢和300日龄总产蛋量相关;
结合前面两章的结果,将GARNL1基因做为候选基因进行研究,分析该基因17个多态位点与鸡繁殖性状的相关性分析。结果表明,位点rs16492011、rs14532787、rs16492056、rs15700989和rs14532750均表现与鸡300日龄总产蛋量显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01);位点rs16492027、rs16492031、rs16492056、rs14532831和rs15701119与鸡开产日龄显著或极显著相关(P<0.05或P<0.01);由位点rs14532787和rs14532779组成的单倍型与鸡300日龄总产蛋量呈极显著相关(P<0.01);GARNL1基因的变异对家鸡繁殖性状具有遗传效应。
本试验通过Western Blot检测到鸡的GARNL1存在着不同的蛋白亚型。通过克隆鸡GARNL1基因序列,获得了5种不同的剪接体(分别命名为GARNL1-w、GARNL1-v1、GARNL1-v2、GARNL1-v3和GARNL1-v4),编码区长度分别为6108bp、6261bp、6405bp、5995bp和6609bp。可变剪接的类型为外显子跳跃和内含子保留。GARNL1-w含有41个外显子和40个内含子,GARNL1-v1外显子40(31bp)发生跳跃;GARNL1-v2除了发生外显子40跳跃之外,外显子16和17之间还保留了一段141bp的内含子序列,不引起移码突变;GARNL1-v3的外显子21(153bp)缺失;GARNL1-v4同样含有141bp的内含子保留,还保留有一个201bp的内含子序列;141bp的内含子保留序列具有组织表达特异性,仅在大脑、小脑、下丘脑、心脏、胸肌和腿肌中表达,在产蛋状态下的表达量要高于就巢状态。
家鸡垂体转录组测序共获得16.2G的数据,平均覆盖率为29.9倍。杏花鸡中检测到就巢与产蛋状态下的差异基因有140个(48个上调基因和92个下调基因),白耳黄鸡就巢和产蛋状态的差异基因有232个(32个上调基因和200个下调基因);杏花鸡和白耳黄鸡在就巢状态下共同上调基因有8个,包括PRL在内;共同下调的基因有47个,主要是类固醇激素生物合成通路上的基因;推测PRL可能通过抑制了类固醇生物合成通路上关键基因的表达来影响家鸡的就巢行为,Egr1基因可能影响白耳黄鸡对PRL的敏感性。
综上所述:鸡GARNL1基因是影响鸡繁殖性能的重要候选基因;在mRNA水平上,PRL通过抑制类固醇生物合成通路上的基因来影响就巢行为。