论文部分内容阅读
本文研究了姜黄素对原代培养的肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSC)活化、增殖和凋亡的影响与过氧化物酶体增殖因子活化受体γ(peroxisomeproligeratoractivatedreceptorγ，PPARγ)信号转导途径的关系，在细胞和分子水平阐明姜黄抗肝纤维化的作用机制。
方法：采用原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心的方法分离大鼠HSC，体外培养活化，传一代细胞用于实验。免疫化学荧光染色进行Desmin和PPARγ表达的检测，MTT法检测姜黄素及PPARγ配体对HSC增殖的影响，Hoechst33258染色检测姜黄素对细胞凋亡的影响，半定量RT-PCR和Westernblot方法检测药物干预后HSC内α-SMA、Ⅰ型胶原、PPARγ、Bcl-2、Bax、CyclinD1、TβRⅠ基因和蛋白表达的变化。
结果：倒置显微镜下观察发现传代的HSC呈大片状伸出伪足，胞浆脂滴消失，经过细胞免疫荧光染色鉴定HSC特异性的Desmin表达阳性98％以上。体外培养HSC在活化过程中，PPARγ的基因和蛋白水平表达逐渐降低；半定量RT-PCR和Westernblot发现，30μmol/L姜黄素不仅可以在基因转录水平而且在翻译水平上调PPARγ的表达，细胞免疫荧光染色发现该药物能够促进PPARγ表达和核转位；MTT结果显示，10～50μmol/L姜黄素含药培养液孵育后OD值逐渐降低(P＜0.05)，PPARγ拮抗剂GW9662预处理细胞可以增高30μmol/L姜黄素干预组的OD值(P＜0.05)；RT-PCR和Westernblot结果显示，姜黄素可以抑制HSC活化标志物α-SMA、Ⅰ型胶原的基因和蛋白表达水平，同时应用PPARγ拮抗剂可以部分阻断姜黄素的作用；姜黄素能够诱导促进HSC的凋亡，抑制CyclinD1、Bcl-2，促进Bax基因和蛋白的表达，应用GW9662预处理细胞后可以逆转这种变化。
结论：姜黄素能够抑制HSC增殖与活化，其机制与抑制细胞周期蛋白，下调TGFβⅠ型受体表达有关；姜黄素可以诱导HSC的凋亡，上调Bax下调Bcl-2从而提高Bax/Bcl-2比例是该作用的重要机制；PPARγ随HSC的活化，表达逐渐降低；姜黄素能促进PPARγ的表达，并通过增强PPARγ信号传导发挥以上作用；增强PPARγ信号传导从而抑制HSC活化可能是姜黄“活血”抗肝纤维化的重要分子机制之一。
姜黄素激活PPARγ下调肝星状细胞α平滑肌肌动蛋白和Ⅰ型胶原的基因表达水平
[目的]研究姜黄素抑制大鼠肝星状细胞(HSC)活化作用与过氧化物酶体增殖因子活化受体(PPARγ)信号转导途径之间的关系。[方法]肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心方法分离培养大鼠HSC，并使用药物对细胞进行相应处理，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色分析法检测药物对细胞增殖的影响。收集裂解细胞并抽提细胞总RNA，采用半定量RT-PCR检测药物处理对α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原的基因表达水平的影响。[结果]MTT法检测发现姜黄素在10～50μmol/L范围内呈剂量依赖性抑制体外培养大鼠传代HSC的增殖，半定量RT-PCR方法检测结果发现姜黄素能够在基因水平显著降低α-SMA(P＜0.05)和Ⅰ型胶原的基因表达水平(P＜0.01)，而且姜黄素的这些作用均可以被PPARγ特异性阻断剂GW9662阻断。[结论]姜黄素抑制HSC增殖、活化和合成Ⅰ型胶原的作用依赖于PPARγ信号转导途径的激活。