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黄姑鱼和鲈鱼是两种重要的海洋经济鱼类，但是由于过度捕捞和全球气候变暖等原因，这两种鱼的天然产量不足以满足人们的需求，这样人工繁殖就显得尤为必要。超低温冷冻技术是一种种质资源的新技术，并且能够为人工育苗和遗传育种提供技术支持和材料供应。本文研究的主要内容是通过对稀释液、抗冻剂、冷冻速率等条件的筛选，建立一种高效的超低温冷冻保存黄姑鱼和鲈鱼精子的方法。同时我们还对解冻前后精子的质量进行了包括精子超微结构、质膜完整性、线粒体膜电位、Hsp90蛋白含量、脂类含量以及DNA损伤等全方位评价，对超低温冷冻处理对精于结构以及相关功能的影响做了分析。
在对黄姑鱼（Nibeaalbiflora）精子的超低温冷冻研究中，首先要筛选黄姑鱼精子超低温冷冻保存所需要的激活液和稀释保护液的种类和浓度，为精子超低温冷冻保存做好准备工作。激活液筛选实验的研究结果表明：精子活力随着CF-HBSS、KCl、NaCl和Gle四种激活液渗透压的升高而增大，直到渗透压达到700mOsm/kg时，精子活力达到最大，但是它们之间没有显著性差异(p=0.803)。渗透压高于700mOsm/kg后，精子活力随渗透压增高而减小。在700mOsm/kg渗透压时，精子活力持续时间较短(2.8min)，而在用CF-HBSS和KCl作为激活液，渗透压为400mOsm/kg时，虽然精子活力只达到15％-26％，精子活力持续时间却长达7-7.5min。近一步的比较表明Glc700和海水作为激活剂都好于CF-HBSS700、KC1700、NaC1700作为激活剂，但是这五者之间没有显著性差异(P=0.517)。单独比较Glc发现，Glc700和Glc750作为激活剂都取得较高的精子活力：(81±19)％和(82±6)％，但是它们和Glc625、Glc650、Glc675、Glc725、Glc775以及海水(710mOsm/kg)作为激活剂均没有显著性差异(p=0.886)。所以Glc700和SW被选为激活剂。在后续的实验过程中，用Glc700和SW作为激活剂所得的精子活力没有显著性差异。鲜精激活时与激活液的比例以1:20为宜。稀释保护液的实验表明：CF-HBSS和海洋Ringers溶液都取得了比较好的保存效果，从总体效果来看CF-HBSS在150、270、300mOsm/kg三个渗透压作为保护稀释液所取得的活力都高于处于相同渗透压的海洋Ringers溶液，但是两者没有显著性差异(p=0.067)，但是仅仅从渗透压水平来看，两种保护稀释液在150mOsm/kg时得到的活力都明显高于300mOsm/kg(p=0.042)，所以最终选择CF-HBSS150作为短期保存精子的稀释液。短期保存的温度在4℃冰箱内明显优于室温保存。
黄姑鱼精子超低温冷冻保存过程中，抗冻剂和冷冻速率起着至关重要的作用。本实验共选用了三种抗冻剂：DMSO、EG和Gly，每种抗冻剂选用了四个浓度梯度：5％、10％、15％、20％;精子的冷冻采用了四个不同高度的泡沫船1、3.4、5、7cm来控制得到四种冷冻速率。实验过程中发现用Gly作为抗冻剂没有效果。DMSO和EG这两种抗冻剂在适合的浓度和合适的冷冻速率条件下，都能取得比较好的精子活力：从冷冻速率来说，采用1cm高度的泡沫船快速冷冻无论从精子活力方面，还是从精子活力持续时间上都具有很强的优势。用1cm高度的泡沫船快速冷冻黄姑鱼精子后解冻，从精子活力方面分析，采用DMSO作为抗冻剂时，M(10％)＞M(5％)＞M(15％)＞M(20％)，但是它们之间没有显著性差异(p＞0.05)；采用EG作为抗冻剂时M(5％)＞M(15％)＞M(10％)＞M(20％)，它们之间除了5％EG与20％之间存在显著性差异外(p＜0.05)，其余各浓度之间没有显著性差异(p＞0.05);DMSO和EG这两种抗冻剂相比较，5％EG作为抗冻剂获得的精子活力显著性大于5％DMSO作为抗冻剂(p＜0.05)，与10％DMSO作为抗冻剂获得的结果没有显著性差异(p＞0.05)。从精子活力持续时间方面分析，无论是两种抗冻剂内部相比，还是两种抗冻剂之间的相比均没有显著性差异(p＞0.05)。本实验又进一步比较了1cm高度的泡沫船快速冷冻下，5％EG和5％DMSO作为抗冻剂获得的精子活力和精子活力持续时间，从解冻后精子活力分析，M(5％EG)M(5％DMSO)(p＜0.05);从解冻后精子活力持续时间分析，T(5％EG)T(5％DMSO)(p＞0.05)。总之，最终结果是5％EG和10％DMSO作为抗冻剂，采用1cm高度泡沫船快速冷冻黄姑鱼精子取得最好的效果，二者没有显著性差异。
我们对黄姑鱼精子质量进行了全方位的评价：精子扫描电镜结果显示，鲜精组和添加5％EG抗冻剂组精子头颈尾结构完整，添加5％DMSO冷冻组较少部分精子头部溶解和脱落或者尾部缺失，CF-HBSS未加入抗冻剂冷冻组较大部分精子头部溶解和脱落或者尾部缺失。用SYBR14/PI双染色方法检测黄姑鱼精子质膜完整性表明，冷冻后精子质膜完整性都有极显著性下降(p＜0.01)，黄姑鱼精子冷冻过程中加入抗冻剂有利于保护质膜完整性，5％EG作为抗冻剂的效果显著性好于10％DMSO。HPLC分析精子内脂类含量发现，CHO含量除了不加入抗冻剂组与鲜精有显著性差别外(p=0.0465)，添加DMSO和EG的处理组均与鲜精没有显著性差异(p=0.123和0.1212)；对于其他三种脂类（PE、PC和SM），鲜精与添加不同抗冻剂处理后的精子内的脂类含量均有显著性差异，而各处理组之间没有显著性差异。用JC-1试剂盒检测精子内线粒体膜电位的：黄姑鱼精子经过超低温冷冻后精子内线粒体膜电位发生了显著性下降(p＜0.05)，两种抗冻剂（5％EG和10％DMSO）的作用相比较，5％EG的膜电位要高于10％DMSO，但两者之间没有显著性差异(p＞0.05)。WesternBlot分析Hsp90的表达情况的：冷冻组精子包括EG组、DMSO组和CF-HBSS组的Hsp90的绝对值（Hsp90/Tubulin）含量较之于鲜精都有所降低，但是加入抗冻剂的组（5％EG或者10％DMSO）与鲜精组没有显著性差异（p＞0.05），未加入抗冻剂的CF-HBSS组与其他三组之间均有显著性差异(p＜0.05)。彗星电泳分析精子DNA的损伤。鲜精组、EG组和DMSO组TDNA％分别为(0.88±0.29)％、(9.34±1.53)％和(13.38±2.85)％。冷冻组TDNA％和OTM值比鲜精组显著性增高(p＜0.05)，两个冷冻组之间没有显著性差异（p＞0.05）。
鲈鱼精子的超低温冷冻保存实验中，选择基础液和CF-HBSS300为稀释液，以DMSO，Gly以及二者混合液作为抗冻剂对鲈鱼精子进行超低温冷冻保存，对解冻后精子我们进行了活力分析和SYBR14/PI染色实验。结果显示，12.5％Gly和6.5％DMSO混合作为抗冻剂，用1cm高度的泡沫船快速冷冻获得最好的冷冻效果，同时，CF-HBSS300作为稀释液，较之于基础液能够获得更好的冷冻效果。对于解冻后精子活力，我们采用了CASA直接检测活力和通过染色判断死活精子比例相结合的方法，结果显示，利用CASA检测的活力与染色方法获得的结果之间有很大的相关性(r2=0.727)。