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维生素B12是一种重要的生物活性物质,广泛应用于医药、食品等各个领域。本论文围绕脱氮假单胞杆菌发酵生产维生素B12过程中所表现出的奇特的呼吸代谢特性进行研究,提出了有效的发酵过程优化控制策略,为维生素B12发酵生产工艺的优化与放大提供了指导和借鉴。
建立了维生素B12发酵过程中种子培养在线控制指标及以氧消耗速率(OUR)为指标的在线供氧控制策略。研究了供氧对种子质量的影响以及移种时机对发酵过程的影响,确定了以溶氧、pH和菌体浓度变化相结合作为种子培养的质量控制标准,在种子培养过程中维持溶氧浓度为15-20％,同时紧密监控pH值和菌体形态的变化,OD700达到15以上时进行移种。研究发现,该生产菌对氧有很高的亲和力,整个发酵过程都处于极度的氧限制状态下,溶氧已经不能作为发酵过程的控制标准。通过对不同OUR下菌体代谢和产物合成情况的考察,发现在不同发酵阶段控制不同的OUR能明显促进维生素B12的合成,以此建立了以OUR为指标的在线供氧控制策略,并在120m3反应器上成功放大,发酵单位提高了15.8％,底物葡萄糖消耗降低了20.3％。
探讨了溶解CO2浓度对维生素B12发酵过程的影响。进气中不同CO2浓度的添加实验结果表明,当溶解CO2浓度为3.05mM时能明显促进维生素B12的合成,同时使得转化率明显提高。通过胞内酶活的测定和代谢途径通量的分析,进一步证实了一定浓度的溶解CO2下丙酮酸羧化酶活性有所提高,促进了TCA循环中C4骨架物质的再生,增加了用于维生素B12合成的前体谷氨酸和琥珀酰CoA的生成,使得与维生素B12相关的代谢途径通量增强,促进了维生素B12产量的提高。在50 L反应器上,通过对转速、流量和罐压的调整,控制溶解CO2浓度为1.56 mM,最终发酵单位提高了10.1％。