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近年来，由过量饮酒导致的酒精性肝病已成为威胁人类健康的世界性公共卫生问题。酒精性肝病发病机制复杂，尚无明确靶向治疗药物。因而，通过膳食补充营养功效因子，调控人体代谢来改善肝损伤症状的策略逐渐受到人们重视。生物活性肽因氨基酸组成和序列不同而表现出多种生物活性，被认为是调节机体代谢、促进人体健康的天然功效因子。本文以鸡胸肉为原料，通过控制酶解技术制备乙醇脱氢酶(ADH)激活肽，探讨其在食品加工和胃肠道消化过程中的稳定性，并通过体外和小鼠模型评价其加速酒精代谢、缓解酒精性肝损伤的功效和作用机理。在此基础上对ADH激活肽进行分离纯化，鉴定发挥活性的关键肽段，并探究其激活ADH的分子机制，为活性肽的实际生产和应用提供理论依据和方法指导。具体研究内容和结果如下：
(1)以ADH激活率为指标，研究了5种商业酶(Alcalase、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶)和5个水解时间(1、2、4、8和12h)处理对制得ADH激活肽活性的影响。结果表明Alcalase(0.5%，55℃)水解8h制备的ADH激活肽具有较强ADH激活活性(激活率90%，2mg/mL)。物化稳定性研究表明ADH激活肽在加热处理(25、40、60、80、100和121℃，60min)、酸碱处理(pH2、4、6、8、10和12)、多离子强度(0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2MNaCl)和低浓度的金属离子(<0.1mMZn2+、Ca2+、Fe2+和Fe3+)作用下均保持稳定。体外胃肠道模拟消化试验表明ADH激活肽对胃部消化稳定，且经肠道消化后可保持70%活性，具有较高的应用潜力。
(2)建立急性酒精性肝损伤小鼠模型，评价ADH激活肽的体内活性。结果表明摄入ADH激活肽能显著提高酒精的代谢速率、缓解小鼠肝损伤症状。行为学研究表明，在高剂量下(600 mg/kg)，小鼠的翻正反射消失(LORR)发生率下降50%，LORR潜伏时间由延长一倍，而持续时间缩短一半，表明小鼠对酒精的耐受性大大增加。生化分析和组织病理学分析表明摄入ADH激活肽显著减轻小鼠的肝损伤症状。一方面，ADH激活肽提高小鼠肝脏主要酒精代谢酶系的活力(ADH和ALDH)，加速血液中酒精及其代谢产物的清除，降低其对肝组织的直接损伤；另一方面，小鼠肝脏抗氧化酶SOD的活力提高28.6%，而脂质过氧化程度降低54.3%(MDA)。两方面共同作用下，小鼠的血液转氨酶(AST和ALT)下降到正常水平、肝脏甘油三酯含量显著下降、脏组织病变消失，表明ADH激活肽的摄入对小鼠的酒精性肝损伤具有显著的保护作用。
(3)以ADH激活活性为导向，采用分子排阻色谱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱串联质谱和计算机辅助筛选等技术对关键活性肽段进行分离鉴定，经肽段合成和活性验证，发现3条肽段(DPQYPPGPPAF、KPC和APGH)可显著激活ADH。其中活性最强的KPC(5 mM)能使ADH在37℃保温120min后保持将近100%的活力(同条件下ADH对照完全失活)，表明KPC可显著提高ADH稳定性。进一步的荧光猝灭和分子对接研究发现KPC可能通过两个氢键以及疏水相互作用结合到ADH的催化活性中心，进而防止Cys-43和Cys-153残基氧化修饰来维持ADH分子结构的稳定。
(4)基于小鼠实验结果进一步以抗氧化活性为指标，对ADH激活肽中的抗氧化肽段进行分离鉴定。经SEC和HPLC两级分离后，采用液相色谱串联质谱技术从抗氧化活性最强的组分中鉴定到22条肽段，其中MH、YR、HY、YQ、YE和IE均已被报道具有很强的自由基清除能力。此外RWGG、YYCQ、KAPKL、EVH和HED为首次报道，其序列中均含有已报道抗氧化肽片段(RW、WG、YY、CQ、KA、VH和HE)。这些抗氧化肽段的存在使ADH激活肽具有清除ROS潜力，可能是其提升小鼠肝脏SOD活力、抑制肝脏脂质过氧化，进而缓解肝脏氧化损伤的关键因素。
(5)以鸡胸肉为原料，研究蒸煮和体外消化对鸡胸肉内源肽组成和生物活性的影响。结果表明鸡胸肉内源肽具有ADH激活和抗氧化活性，但其ADH激活活性及稳定性均弱于由Alcalase水解制得的ADH激活肽，表明Alcalase水解过程对关键活性肽段的释放非常关键。蒸煮过程未显著改变内源肽的活性，但进一步体外消化导致其ADH激活、还原力及DPPH自由基清除活性大幅下降，而ORAC和ABTS自由基清除活性显著提高。进一步采用nano-LC-MS/MS对内源肽进行全组分鉴定和定量，共检测到777条肽段。经肽组学分析发现蒸煮和体外消化显著改变内源肽的组分和含量，源于肌联蛋白(Titin)和胶原蛋白(Collagen)的肽段对组分差异和活性变化的贡献最大。其中，胶原蛋白肽序列中的Pro残基蒸煮和体外消化过程的氧化，可能是导致内源肽活性下降的关键因素。这些结果表明膳食补充鸡胸肉具有加速酒精代谢、缓解酒精性肝损伤的潜在功效，而通过酶解技术能有效提高关键肽段的释放，且制得ADH激活肽更加稳定，对ADH激活肽的开发具有重要意义。
(1)以ADH激活率为指标，研究了5种商业酶(Alcalase、中性蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶)和5个水解时间(1、2、4、8和12h)处理对制得ADH激活肽活性的影响。结果表明Alcalase(0.5%，55℃)水解8h制备的ADH激活肽具有较强ADH激活活性(激活率90%，2mg/mL)。物化稳定性研究表明ADH激活肽在加热处理(25、40、60、80、100和121℃，60min)、酸碱处理(pH2、4、6、8、10和12)、多离子强度(0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.5、1和2MNaCl)和低浓度的金属离子(<0.1mMZn2+、Ca2+、Fe2+和Fe3+)作用下均保持稳定。体外胃肠道模拟消化试验表明ADH激活肽对胃部消化稳定，且经肠道消化后可保持70%活性，具有较高的应用潜力。
(2)建立急性酒精性肝损伤小鼠模型，评价ADH激活肽的体内活性。结果表明摄入ADH激活肽能显著提高酒精的代谢速率、缓解小鼠肝损伤症状。行为学研究表明，在高剂量下(600 mg/kg)，小鼠的翻正反射消失(LORR)发生率下降50%，LORR潜伏时间由延长一倍，而持续时间缩短一半，表明小鼠对酒精的耐受性大大增加。生化分析和组织病理学分析表明摄入ADH激活肽显著减轻小鼠的肝损伤症状。一方面，ADH激活肽提高小鼠肝脏主要酒精代谢酶系的活力(ADH和ALDH)，加速血液中酒精及其代谢产物的清除，降低其对肝组织的直接损伤；另一方面，小鼠肝脏抗氧化酶SOD的活力提高28.6%，而脂质过氧化程度降低54.3%(MDA)。两方面共同作用下，小鼠的血液转氨酶(AST和ALT)下降到正常水平、肝脏甘油三酯含量显著下降、脏组织病变消失，表明ADH激活肽的摄入对小鼠的酒精性肝损伤具有显著的保护作用。
(3)以ADH激活活性为导向，采用分子排阻色谱(SEC)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱串联质谱和计算机辅助筛选等技术对关键活性肽段进行分离鉴定，经肽段合成和活性验证，发现3条肽段(DPQYPPGPPAF、KPC和APGH)可显著激活ADH。其中活性最强的KPC(5 mM)能使ADH在37℃保温120min后保持将近100%的活力(同条件下ADH对照完全失活)，表明KPC可显著提高ADH稳定性。进一步的荧光猝灭和分子对接研究发现KPC可能通过两个氢键以及疏水相互作用结合到ADH的催化活性中心，进而防止Cys-43和Cys-153残基氧化修饰来维持ADH分子结构的稳定。
(4)基于小鼠实验结果进一步以抗氧化活性为指标，对ADH激活肽中的抗氧化肽段进行分离鉴定。经SEC和HPLC两级分离后，采用液相色谱串联质谱技术从抗氧化活性最强的组分中鉴定到22条肽段，其中MH、YR、HY、YQ、YE和IE均已被报道具有很强的自由基清除能力。此外RWGG、YYCQ、KAPKL、EVH和HED为首次报道，其序列中均含有已报道抗氧化肽片段(RW、WG、YY、CQ、KA、VH和HE)。这些抗氧化肽段的存在使ADH激活肽具有清除ROS潜力，可能是其提升小鼠肝脏SOD活力、抑制肝脏脂质过氧化，进而缓解肝脏氧化损伤的关键因素。
(5)以鸡胸肉为原料，研究蒸煮和体外消化对鸡胸肉内源肽组成和生物活性的影响。结果表明鸡胸肉内源肽具有ADH激活和抗氧化活性，但其ADH激活活性及稳定性均弱于由Alcalase水解制得的ADH激活肽，表明Alcalase水解过程对关键活性肽段的释放非常关键。蒸煮过程未显著改变内源肽的活性，但进一步体外消化导致其ADH激活、还原力及DPPH自由基清除活性大幅下降，而ORAC和ABTS自由基清除活性显著提高。进一步采用nano-LC-MS/MS对内源肽进行全组分鉴定和定量，共检测到777条肽段。经肽组学分析发现蒸煮和体外消化显著改变内源肽的组分和含量，源于肌联蛋白(Titin)和胶原蛋白(Collagen)的肽段对组分差异和活性变化的贡献最大。其中，胶原蛋白肽序列中的Pro残基蒸煮和体外消化过程的氧化，可能是导致内源肽活性下降的关键因素。这些结果表明膳食补充鸡胸肉具有加速酒精代谢、缓解酒精性肝损伤的潜在功效，而通过酶解技术能有效提高关键肽段的释放，且制得ADH激活肽更加稳定，对ADH激活肽的开发具有重要意义。