论文部分内容阅读
手足口病是五岁以下儿童常见的传染性疾病，近十年来在亚太地区爆发和流行，严重威胁着儿童的健康和生命安全。柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CA16)是手足口病的一个主要致病原，但目前尚无上市的抗CA16预防性疫苗或治疗性药物。处于研发阶段的CA16灭活全病毒疫苗和重组病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)疫苗的动物攻毒试验显示，中和抗体在抵抗病毒感染扮演重要角色。因此，开展针对CA16中和抗体的应用基础研究，揭示CA16中和抗体的诱导、功能及其抗病毒分子机理，对于开发安全有效的CA16疫苗和治疗性药物具有重要的指导意义。 本研究围绕抗CA16中和抗体这一核心，开展三部分的研究工作，包括:(1)CA16线性中和表位的鉴定;(2)抗CA16中和性单克隆抗体的制备、特性分析及抗病毒效果评价;(3)抗CA16中和性单克隆抗体的作用机制的探索。 第一部分工作中，我们鉴定出了6个CA16的线性中和性表位。首先通过多肽ELISA分析CA16-VLP抗血清与95条针对CA16衣壳蛋白VP1多肽的结合活性，筛选到15条CA16的B细胞表位肽，进而通过分析15条表位肽对CA16-VLP抗血清的中和抑制作用，发现PEP32、PEP37、PEP55、PEP63、PEP71和PEP91这6条多肽可以显著抑制抗血清的中和效果，使中和滴度为32，000的VLP抗血清在1∶8，000时都不能中和CA16病毒。通过免疫荧光和免疫印迹分析发现该六条多肽免疫小鼠所得的多肽抗血清可以特异性识别CA16。更重要的是，这些多肽抗血清可以中和同源和异源的CA16病毒，表明这六条多肽代表的是中和表位。这些中和表位在CA16病毒样颗粒的表面:PEP32、PEP37、PEP55和PEP71分别展示在CA16病毒样颗粒表面突出的BC、CD、EF和GH环状结构上;PEP91在VP1的C末端表面;PEP63部分展示在表面，部分残基包埋在颗粒内部。比对不同亚型的CA16相应位点的氨基酸序列发现这些表位的序列高度保守。 第二部分工作中，我们获得了CA16的单克隆抗体，建立了CA16候选疫苗的检测、鉴定和定量体系，分析了CA16单抗的生物学特性，并评价了单抗9B5的体内外抗病毒活性。 用CA16灭活病毒免疫小鼠，通过杂交瘤技术筛选到的四株单克隆抗体2H7、8C4、9G1和9B5均可以特异识别CA16，单抗9B5或9G1作为捕获抗体，biotin标记的9B5为检测抗体，建立的夹心ELISA可以灵敏地检测到浓度低至0.025ng/μl的CA16。 体外中和试验发现四株单抗2H7、8C4、9G1和9B5中和CA16的IC95(100％保护细胞不出现病变的最低浓度)分别为0.3μg/ml、0.3μg/ml、0.01μg/ml和0.001μg/ml。鉴于单抗9B5强大的中和能力，我们首先在CA16-G08感染的小鼠模型上评价其预防效果，单剂量2μg的9B5可以100％预防CA16-G08对2日龄小鼠的攻击，而对照抗体2G9组和PBS组小鼠的存活率仅为43％和29％;我们进一步在CA16-G08或CA16 G08-MAV感染的小鼠模型上评价单抗9B5的治疗效果，CA16感染小鼠1天或3天后，单剂量的9B5(1μg/g)均可以100％保护小鼠;而CA16-G08感染5天时，小鼠已出现严重的瘫痪症状，再给予5μg/g或25μg/g的9B5，可以显著减轻小鼠的临床症状，并提高小鼠的存活率约至85％。同时，我们发现CA16G08-MAV感染5天后，注射5μg/g的9B5没有显示出显著的治疗效果，但25μg/g的9B5显著改善小鼠的临床症状，并提高感染小鼠存活率至87％，而对照组小鼠存活率仅为37％，显示了单抗9B5强大的抗病毒活性。为了进一步提高其临床应用潜力，我们通过5RACE法获得单抗9B5的基因序列，并成功构建了鼠源单抗9B5的人鼠嵌合抗体c9B5，c9B5与鼠源抗体9B5具有类似的特异性和生物学活性，而且单剂量的c9B5(1μg/g)即可完全保护CA16-G08-MAV致死剂量的攻击，因而，人源化的单抗9B5将是CA16理想的候选药物。 第三部分的工作中，我们探讨了CA16单抗9B5的抗病毒机制。我们首先发现单抗9B5可以阻止CA16吸附敏感细胞。由于CA16的吸附受体目前未知，我们证明了硫酸乙酰肝素为CA16在靶细胞上的吸附受体:免疫沉淀实验发现硫酸乙酰肝素可以与CA16结合，可溶性的肝素钠可以完全抑制CA16的感染，氯酸钠处理细胞可以有效抑制CA16感染细胞。进一步研究发现单抗9B5呈剂量依赖方式阻断CA16与肝素的结合。而病毒吸附细胞后高剂量的单抗9B5(3.125μg/ml)才能限制病毒进入细胞，这些结果表明，单抗9B5主要通过干预CA16与硫酸乙酰肝素的结合而阻止病毒吸附细胞，从而发挥抗病毒作用。 综上，我们得出以下结论: (1)我们鉴定出CA16的6个线性中和表位:PEP32、PEP37、PEP55、PEP63、PEP71和PEP91。这些表位大多处于病毒颗粒的表面，序列高度保守，为理解疫苗诱导中和性抗体和设计安全有效的CA16疫苗提供了重要信息; (2)利用CA16的中和性单克隆抗体9B5和9G1建立了候选疫苗的检测、鉴定和定量体系; (3)单抗9B5对CA16病毒具有强大的体内外抗病毒活性，表明其可以作为预防和治疗CA16感染的备选药物来进一步的人源化改造。 (4)我们鉴定细胞表面的硫酸乙酰肝素为CA16感染细胞的吸附受体; (5)单抗9B5主要通过阻断CA16与硫酸乙酰肝素的结合抑制CA16吸附细胞，进而发挥抗病毒作用。