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背景：Tim-3属于T细胞免疫球蛋白及黏蛋白家族（T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein Tims），2002年Tim-3首次发现于活化的Th1细胞表面。半乳凝素-9（Galectin-9,Gal-9）是Tim-3的配体，广泛表达于多种细胞，Tim-3与其配体结合可显著抑制T细胞的活化和增殖，维持体内免疫耐受。近年来发现Tim-3也表达于天然免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞、NK细胞、DC细胞等。各类感染性疾病严重危害患者的生命健康。病毒在感染过程中演化出了一系列的机制抵抗宿主的免疫应答，例如流感病毒能够通过抑制抗病毒免疫效应分子Ⅰ型干扰素（TypeⅠInterferon）的产生而拮抗宿主的抗病毒反应，从而对人畜共患极具危险性。临床研究表明，H7N9感染患者T细胞表面Tim-3表达上调，并且伴有干扰素表达水平的下调[1]；动物实验表明，小鼠感染流感病毒后，肺部的Tim-3表达明显升高。鉴于Tim-3与免疫耐受的关系，阻断Tim-3通路是否增强免疫细胞的抗病毒免疫反应等目前尚不清楚，且是非常值得探讨的课题。Tim-3在免疫相关性疾病临床治疗中的应用前景越来越受到人们的重视，但目前尚没有成熟的干预药物问世。我们实验室在前期制备了能阻断Tim-3与其配体结合的制剂重组人Tim-3-Fc融合蛋白的基础上（已经申请获得国家发明专利），对该融合蛋白的功能进行了进一步的评价，同时本研究还制备了抗人Tim-3抗体，期望能为研发以Tim-3为靶点的生物药物奠定基础。 目的：在前期制备重组人Tim-3-Fc融合蛋白的基础上，评价其生物学活性，并进一步制备抗人Tim-3抗体，利用细胞及体外感染模型系统评价Tim-3-Fc融合蛋白及Tim-3抗体在阻断Tim-3生物学功能中的作用，并初步探究其作用的机制，明确将其用作Tim-3干预药物的可行性。 方法：⑴基于Tim-3融合蛋白可以竞争性阻断Tim-3与其配体的结合，以表达Tim-3的巨噬细胞系、淋巴细胞系以及人外周血细胞为模型，利用ELISA以及Real-time PCR的方法观察其中炎性因子水平的变化（包括IL-8、IL-2和IFN-γ）以及Ⅰ型干扰素的表达，验证其体外活性。⑵运用制备的人重组Tim-3蛋白，按照常规方法免疫BALB/c小鼠，筛选出阳性克隆，并将阳性杂交瘤细胞打回小鼠体内，抽取腹水并进行纯化制备抗体；⑶鉴定制备的Tim-3单抗的结合特异性；⑷对所制备的单克隆抗体的中和活性进行验证：基于Tim-3抗体可以竞争性结合Tim-3从而阻断其与配体的结合，以表达Tim-3的巨噬细胞系以及人外周血细胞为模型利用ELISA和Real-time PCR的方法检测其中炎性因子及Ⅰ型干扰素的变化；⑸利用人PBMC建立H1N1病毒感染的体外模型，使用Real-time PCR方法测定Tim-3表达量的变化，然后使用Tim-3单抗进行干预，检测病毒载量及Ⅰ型干扰素变化情况，初步探讨其在抗病毒免疫中的作用机制。 结果：①鉴定了实验室前期制备的重组人Tim-3-Fc融合蛋白的结合活性，发现其能竞争性的阻断巨噬细胞等细胞表面Tim-3与其配体的结合，增加炎性因子IL-8、IL-2、IFN-γ以及Ⅰ型干扰素的分泌。②抗人Tim-3单克隆抗体制备及鉴定：获得了一株能够分泌具有较好活性的抗人Tim-3单克隆抗体细胞株（克隆号L3G)，其分泌的免疫球蛋白亚型为IgG2a；流式结果表明，该抗体能够结合人巨噬细胞系U937和Jurkat细胞表面的Tim-3分子以及外源转入细胞的Tim-3分子，ELISA结果也表明其可与人Tim-3融合蛋白特异性结合，但流式结果表明，L3G抗体不与小鼠来源的巨噬细胞系（RAW264.7）表面的Tim-3结合，说明其结合活性具有种属特异性；该抗体能够阻断人巨噬细胞系以及外周血细胞中Tim-3的信号，增加炎性因子以及Ⅰ型干扰素的分泌；在H1N1病毒感染的体外模型中，发现随着感染时间的延长Tim-3表达也呈上升趋势，当加入L3G抗体进行阻断后，病毒载量有所下降，并且Ⅰ型干扰素的表达上调，提示其具有一定的增强病毒免疫的作用。 结论：⑴重组人Tim-3-Fc融合蛋白在体外细胞模型中具有阻断Tim-3功能的作用；⑵成功制备了一株分泌抗人Tim-3抗体的杂交瘤细胞株，并纯化制备了鼠抗人的单克隆抗体L3G，其与Tim-3的结合具有种属特异性；⑶L3G能阻断Tim-3与其配体的结合从而抑制Tim-3的信号，在体外H1N1病毒感染模型中L3G能增强抗病毒免疫，其作用的机制可能是通过影响Ⅰ型干扰素的表达来调控抗病毒免疫的。