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从印染厂活性污泥中分离到的一株能高效降解苯胺的细菌菌株AD9,其最高耐受苯胺浓度为4500mg/l,在18小时内将起始浓度为1000mg/l的苯胺完全降解。经传统菌株表型比较、16SrDNA序列同源性比对（GenBank登录号:AY89912）、GC含量测定以及标准菌株DNA-DNA杂交分析,将该菌鉴定为Delftia tsuruhatensis AD9。采用脉冲场电泳和Southern杂交实验结果表明,AD9的苯胺降解基因簇位于染色体上。本工作有关Delftia tsuruhatensis的苯胺降解能力以及苯胺代谢基因簇的染色体定位特征研究属首次报道。 利用苯胺不完全降解时中间产物的显色反应如当邻苯二酚（Catechol）代谢被阻断时,邻苯二酚累积后自身氧化成棕色;和2-羟粘康酸半醛（HMS）代谢被阻断或邻苯二酚双加氧酶过量表达时,因HMS累积而呈现金黄色,建立了简便快速的苯胺代谢途径相关基因的功能筛选方法。从构建的AD9的基因文库中筛选得到三个阳性克隆,分别为含9.3kb HindⅢ插入片段的棕色阳性克隆pDA1、含大小为15.4kb的HindⅢ插入片段的金黄色阳性克隆pDBⅡ和含8.2kb EcoRⅠ插入片段的金黄色阳性克隆pDB2。Clark-type电极测定重组子pDA1的苯胺双加氧酶酶活为32±3mg O2/（g dry、Wt）.h;内源呼吸16±2 mg O2/（g dry Wt）.h。pDA1在含苯胺的LB液体培养基上培养24小时后,GC/MS分析产物的化学性质:主要的特征离子在m/z 92（M+-H2O）,81（M+-CHO）,64（M+-H2O,-CO）,与邻苯二酚标准品的结果完全一致。比色法测定重组子pDB2的邻苯二酚2,3双加氧酶（C23O）酶活为3.2 units/mg protein。 对三个阳性克隆pDA1、pDB2和 pDB11进行核苷酸序列分析,经拼接获得一段大小为24.7kb的序列（GenBank登录号AY940090）,包含25个开放阅读框,其中至少含有17个与苯胺代谢有关的基因,命名为tad QTA1A2BRD1C1D2C2EFGIJKL。基因簇两侧含转座酶和IS1071序列。调控基因tadR编码赖氨酸型调控蛋白。tadQTA1A2B基因簇的表达由一个启动子控制,编码多组分的苯胺双加氧酶。tadD1C1D2C2EFGIJKL基因簇的表达由一个启动子控制,编码参与邻苯二酚间位裂解途径所有的酶系,其中tadD1和tadD2编码的两组植物型铁氧化还原蛋白,tadC1和tadC2编码的两组邻苯二酚双加氧酶,功能是催化邻苯二酚的开环反应。余下的tadEFGIJKL基因簇编码2-羟粘康酸半醛脱氢酶（HMSD）、水解酶（HMSH）、2-酮-4-烯戊酸水解酶（OEH）、乙醛脱氢酶（ADA）、4-羟基-2-酮戊酸醛缩酶（HOA）、4-草酰巴豆酸脱羧酶（OCD）和变构酶（OCT）。将邻苯二酚开环所产生的中间代谢产物2-羟粘康酸半醛降解为丙酮酸和乙酰辅酶A。 AD9中苯胺降解基因紧密连锁成簇,两侧由转座酶基因（IS1071）序列环绕,具有典型的基因岛（gene island）特征。AD9中苯胺代谢基因簇tad与Pseudomonas putida UCC22质粒编码的苯胺代谢基因簇tdn在序列和遗传组织上有很高的同源性,进化上可能来自同一个祖先。序列分析表明,tad基因簇是比tad基因簇更古老的基因型。AD9的tad基因簇两侧含有转座酶和IS1071序列.有可能以基因岛为一个转座单元在不同微生物属或种间转移。在AD9苯胺代谢基因簇中有5个功能尚不明确的开放阅读框,在模式菌P.putida UCC22苯胺代谢基因簇中没有发现,表明基因岛作为一个转座单元在不同微生物属或种间转移的同时,可能还伴随着基因的转移或重排,这也可能是污染环境降解微生物的生物多样性形成的一个重要原因。 构建了苯胺降解tad基因簇启动子-lacZ表达载体,β-半乳糖苷酶活性测定结果表明tad基因簇的表达受苯胺诱导。苯胺双加氧酶基因拷贝数增加的重组菌AD91在苯胺浓度600mg/l的A15