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叶片在植物的生长发育过程中具有重要作用。烟草叶片是收获器官,叶片的发育与其产量、品质密切相关。本文鉴定出烟草中的生长素响应因子(ARF)家族成员为46个,并根据NtARFs在不同部位组织或器官以及NAA处理后的表达情况,初步筛选出基因NtARF16。根据红花大金元及其两个突变体材料叶片中GRF家族基因的表达情况,初步筛选出基因NtGRF8。分别对NtARF16、NtGRF8进行分离克隆,初步验证了基因的功能。主要结果如下:1.烟草中含有46个ARF家族成员。其中,35个NtARFs具有典型的ARF蛋白结构,包括N端DBD结构域、Aux_Resp结构域和CTD结构域(Aux_IAA)。在46个NtARFs基因中鉴定到了7类不同的顺式作用组分,分别包含光响应元件、激素响应元件、发育相关元件、环境胁迫响应元件、启动子相关元件、位点结合元件、其它元件。ARF基因受microRNA的调控,在NtARF30、NtARF31、NtARF32、NtARF33、NtARF34、NtARF36、NtARF40、NtARF41、NtARF42序列内预测到了nta-miR160的靶位点,NtARF22、NtARF23、NtARF24、NtARF25、NtARF26、NtARF27序列内预测到了nta-miR167a的靶位点。2.通过实时荧光定量PCR技术,分析ARF家族成员在不同组织或器官以及NAA处理后的表达变化。ARF具有组织表达特异性,其中NtARF11、NtARF38、NtARF44、NtARF45、NtARF14、NtARF3、NtARF8、NtARF9、NtARF16、NtARF24、NtARF28、NtARF29、NtARF34、NtARF8、NtARF9、NtARF14、NtARF44、NtARF45在叶片中的表达量较多。NtARF8、NtARF9、NtARF14、NtARF44、NtARF45在NAA处理后的不同时间点具有相似的的表达模式,处理后48 h内基因表达量提高;NtARF11、NtARF16、NtARF24、NtARF28、NtARF34表现出相似的表达模式,48 h内基因表达量总体趋势为先升后降。NAA处理叶片后,NtARF16对NAA的响应最显著。通过农杆菌侵染和DAPI细胞核染色确定NtARF16蛋白定位在细胞核中。与野生型相比,转NtARF16基因拟南芥叶面积提高了58%,叶片细胞数目增加了43.1%,细胞增大了22%。3.与野生型材料相比叶片突变体(突变体1、突变体2)叶面积分别减少89.88%、16.08%,其中突变体1叶片细胞变小,细胞总数减少89.07%,突变体2细胞增大,细胞总数减少了51.88%。通过定量PCR析发现,突变体1与突变体2中17个GRF家族成员的表达量降低。其中,NtGRF5、NtGRF8、NtGRF25表达下调幅度最大,在突变体1与突变体2中分别降低69.72%和65.57%、80.91%和66.81%、81.59%和68.76%。野生型幼嫩叶片中,NtGRF8、NtGRF19、NtGRF7、NtGRF25、NtGRF5、NtGRF17、NtGRF16、NtGRF20的表达量高于GRF家族中的其它成员。根据红花大金元及其两个突变体材料叶片中GRF基因家族的表达情况,筛选得到基因NtGRF8。通过农杆菌侵染和DAPI细胞核染色确定NtGRF8蛋白定位在细胞核中。与野生型相比,转NtGRF8基因拟南芥叶面积增加41%,叶片的细胞数目增加10.9%,细胞增大61%。突变体1的叶片生长受到抑制的现象更显著,形态特征变化更明显,突变体1叶片中的细胞较小,NtGRF8在突变体1中几乎不表达,而转NtGRF8基因拟南芥的叶片细胞增大,说明NtGRF8有促进叶片中细胞变大的作用。