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研究目的:骨质疏松是一种全身性骨量减少的骨代谢性疾病,主要表现为骨密度降低、骨组织微观结构退化、骨强度下降。骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC）分化为成骨细胞的潜能减弱,而分化为脂肪细胞的能力和趋势增强。因此BMSC向成骨细胞和脂肪细胞分化之间的平衡具有重要意义。大量动物实验表明适宜的运动可以减缓骨质丢失,提高机体骨量、骨密度以及骨生物力学特性,对防治骨质疏松有一定的作用。而细胞实验也表明运动诱导的机械应力可促进BMSC向成骨细胞分化,改善骨代谢。但运动防治骨质疏松的机制尚未完全明确。近年来有研究发现m6A甲基化能在不改变碱基序列的情况下调控基因的转录水平,影响BMSC的生长分化。甲基转移酶样3（methyltransferase-like 3,METTL3）是m6A甲基转移酶之一,在催化m6A甲基化修饰的形成中起着关键作用。研究发现METTL3可参与调节PTH/Pth1r、Wnt和PI3K-Akt等信号通路,进而调控成骨分化进程。但运动/机械应力是否会影响BMSC的m6A甲基化水平,以及运动/机械应力是否可通过调控m6A甲基化影响BMSC成骨分化,尚未见相关报道。因此本研究将以机械应力—m6A甲基化—BMSC为主线,探究机械应力是否可通过调控BMSC的m6A甲基化水平影响其成骨分化,为进一步探究运动防治骨质疏松的作用机制提供理论依据。研究方法:1.小鼠原代BMSC的培养及鉴定选取六周龄的雌性C57BL/6生长期小鼠提取BMSC。无菌条件下提取小鼠股骨及胫骨,用添加青霉素、链霉素的α-MEM培养基,将骨髓冲到培养皿中。用移液枪反复吹打混匀后,放置于37℃、5%二氧化碳培养箱中培养5天;待细胞融合至70～90%,进行传代。通过流式细胞仪检测细胞表面标记:将传至第2代的BMSC经胰酶消化后,用预冷的PBS重悬洗涤,将细胞悬液加入到1.5 m L EP管中,每管细胞密度约1×106个/m L。各管依次加入抗体,避光冰上孵育后用流式细胞仪进行检测分析。2.小鼠原代BMSC成骨分化实验将传至第2代的原代BMSC接种到六孔细胞培养板,分为Day0组、Day1组、Day3组、Day5组、Day7组,共5组。种板12小时后观察细胞完全贴壁,然后对以上5组BMSC进行为期0天、1天、3天、5天、7天的成骨诱导分化培养,分别提取各组细胞的RNA,采用Real-time PCR检测METTL3 m RNA的表达情况。3.小鼠原代BMSC机械牵拉方案将传至第2代的原代BMSC接种到Bio Flex六孔板,待细胞长至80%左右后使用Flexcell-5000细胞牵张仪对细胞进行牵张干预。其中牵张组采用3%牵张强度,0.5Hz,机械牵拉5天,干预时间为4h;对照组进行静置培养。每48小时更换培养液,第5天机械牵张干预结束后收集细胞。通过Real-time PCR检测m6A甲基化相关基因METTL3、METTL14、WTAP、ALKBH5、FTO以及成骨标志基因ALP、RUNX2、Osterix、OCN的表达;Western blot检测蛋白METTL3、RUNX2的表达;ALP染色观察BMSC的成骨分化情况;m6A比色法检测BMSC细胞中m6A甲基化含量。研究结果:1.小鼠原代BMSC的培养及鉴定通过流式细胞术检测BMSC表面标记分子。结果显示,BMSC高表达Sca1（96.8±0.91%）和CD146（83.89±5.28%）,低表达CD45（1.97±0.20%）。2.BMSC诱导成骨分化过程中m6A甲基化及成骨相关基因表达变化Real-time PCR结果显示:与对照组相比,BMSC在成骨诱导第1天和第3天METTL3表达增加但无显著差异;而成骨分化第5天和第7天时,METTL3表达均显著上调（P<0.05）。在诱导BMSC向成骨分化的第3天,细胞内Runx2和ALP的表达显著上升,且随着诱导的时间增加,Runx2和ALP的表达逐渐增加。3.机械牵张对原代BMSC向成骨分化及m6A甲基化的影响ALP染色结果显示:5天连续的机械牵张使BMSC中ALP的分泌显著上调（P<0.01）。m6A比色法定量结果显示:5天连续的机械牵张后BMSC中的m6A甲基化含量显著上升（P<0.05）。Real-time PCR结果显示:5天连续的机械牵张促进了BMSC成骨分化的成骨标志基因ALP（P<0.05）,RUNX2、Osterix、OCN（P<0.01）的表达;此外在牵张后m6A甲基化相关基因METTL3、FTO m RNA的表达显著上调（P<0.05）;而METTL14、WTAP、ALKBH5 m RNA的表达均没有显著变化。Western blot结果显示:5天连续的机械牵张能够促进METTL3、Runx2和ATF4蛋白的表达,METTL3蛋白表达显著上调（P<0.01）,Runx2蛋白和ATF4蛋白表达也均有显著上调（P<0.05）。研究结论:机械牵张应力能刺激细胞内m6A甲基转移酶METTL3及m6A甲基化水平显著上调,并通过诱导成骨分化相关基因ALP,RUNX2,ATF4的表达促进BMSC向成骨分化。