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背景:近日节律广泛存在于生物体的许多生理过程和行为活动中,许多疾病的发生、发展与机体近日节律的异常有关。哺乳动物中,视交叉上核作为近日节律系统级联结构的中枢,协调和同步外周节律振荡器,主要包括心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌和SCN以外的脑区如纹状体,甚至是体外培养的细胞。这些外周组织和细胞的分子节律受控于SCN,但其调控机制仍然不清。
目的:本研究旨在以纹状体为研究对象,探讨脑区外周节律振荡器中分子时钟的发育。同时通过视交叉上核(SCN)脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养建立体外诱导细胞分子时钟振荡模型,并利用该模型进一步研究SCN诱导时钟基因节律振荡的信号及机制。
方法:本研究首先采用照明时间：黑暗时间为12hr:12hr的条件饲养SPF级C57BL/6J小鼠,分别取材出生后第3天(P3)、第14天(P14)的乳鼠和第60天(P60)的成年鼠的纹状体进行实时定量PCR检测Bmall,Clock,Cryl,Perl和Rev-erbα基因的表达。其次探索了微孔滤膜无血清培养SCN脑片的方法,并将不包含SCN区域的部分脑片作为实验对照。在此基础上建立了SCN脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养诱导模型：马血清培养脑片5天后更换无血清培养基；同期进行NIH/3T3成纤维细胞的培养,更换无血清培养基2天后,采用Millicell微孔膜插件进行6天、4天、2天共培养。在连续30小时内对共培养的NIH/3T3成纤维细胞每间隔6小时抽提总RNA,通过实时定量PCR技术检测时钟基因mRNA水平的表达,并进行统计学分析。
结果:
第一部分的研究显示在出生后3天小鼠的纹状体中,单因素方差分析5种时钟基因无显著的昼夜波动。产后14天,仅Rev-erbα存在表达水平昼夜波动；在成熟小鼠中,Bmall,Clock,Perl and Rev-erbα基因的表达均随时间变化。说明时钟基因的表达在发育过程中存在一个动态变化,即在产后3天的小鼠纹状体中最低,14天时有所增加,在成熟后达到峰值。同时比较个体发育过程中各个调节因子的平衡,发现发育早期时钟基因正负环路间不平衡,而在出生后14天比率有所增加并接近成体期。
第二部分的研究中探索SCN脑片微孔滤膜无血清培养成功,其保留了SEN作为节律中枢起搏点的功能；通过焦油紫染色鉴定取材位置正确。利用实时定量PCR检测发现不包含SCN脑片的对照组时钟基因表达没有近日节律性振荡。而在诱导模型共培养6天时,Perl基因和Rev-erbα基因均可被诱导出节律性振荡(p=0.000,p=0.001);在共培养4天和2天时,Perl基因和Rev-erbα基因的表达出现差异,仅Rev-erbα基因表现出显著的近日节律,表达规律与共培养6天的结果一致；而Perl基因的表达日节律性不明显。
结论:本研究的结果证实在小鼠纹状体中时钟基因网络的成熟是一个渐进的过程。并在无血清培养SCN脑片的基础上,成功建立了SCN脑片与NIH/3T3成纤维细胞共培养体外诱导节律振荡的模型,对照组不包含SCN的部分脑片不具备诱导细胞分子时钟节律性表达的能力。