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单宁酰基水解酶(Tanninacylhydrolase,E.C.3.1.1.20),单宁酶(Tannase,EC3.1.1.20)是一种水解酶,可水解植物次生代谢产物单宁酸,裂解其中的酯键和缩酚酸键,生成没食子酸和其他化合物。单宁酶在饮料、化妆、医药、饲料等行业都具有重要应用价值,应用前景广泛。随着人们生活水平的提高,单宁酶的需求量也大大提高。但由于目前单宁酶生产菌株酶活不高,生产水平低,分离纯化困难等原因,限制了单宁酶的规模化应用。
对一株产单宁酶的黑曲霉菌株进行了三轮氮离子束注入诱变,综合考虑N+离子注入对黑曲霉存活率、正负突变率的影响,确定了最佳诱变条件:N+离子注入的能量为10KeV,剂量为60*2.6*1013ions/cm2,利用初筛和复筛两步筛选法,快速高效地获得了一株液态发酵摇瓶总酶活力达111U的生产菌株,比出发菌株提高2.7倍。对诱变菌株的的生长曲线和产单宁酶进程曲线进行了研究,结果显示在30℃、180rpm条件下发酵80h时的酶活最高。
由于液体发酵的局限性,对诱变获得的高产菌株又进行了固态发酵实验。通过单因素实验和响应面法优化了黑曲霉固态发酵生产单宁酶的工艺,通过三因素三水平的优化,得到最佳单宁酶固态发酵优化培养基和培养条件:每250mL三角瓶内含稻壳4.4g、麸皮0.5g和五倍子粉1.1g,液固比2.05:1,接种黑曲霉孢子量5.7×107个,营养盐溶液组成为2.1%(w/v)(NH4)2SO4,0.1%(w/v)MgSO4·7H2O,0.1%(w/v)NaCl,培养基pH值自然,培养温度30℃,培养时间四天。单宁酶活力从40U/gds提高至115U/gds,较未优化前提高了两倍,每单位酶活力的生产成本降低了四倍以上。