施氏假单胞菌碳代谢抑制蛋白Crc的功能鉴定及其固氮条件下的全局调控机制

• 作 者: 林文娜
• 机 构: 中国农业科学院
• 出 处: 中国农业科学院
• 发表日期: 2011年期
• 关键词: 施氏假单胞菌A1501 碳代谢物抑制 全局调控 联合固氮

当生长介质中存在多种碳源时,细菌通常利用优先碳源,同时抑制其它碳源的代谢而达到最佳生长,这种现象称为碳代谢物抑制。不同细菌的碳代谢物抑制调节机制和调控蛋白存在差异,主要通过在转录水平和翻译水平发挥作用。Crc蛋白是假单胞菌碳代谢调控的全局性调控因子,其在联合固氮菌施氏假单胞中的研究未见报道。本研究通过突变株构建、代谢谱分析、酶活测定等方法分析Crc在苯甲酸代谢和固氮过程中的生物学功能;同时利用表达谱技术研究Crc转录组,分析碳氮偶联调控中Crc可能的靶基因,从而探讨Crc参与固氮调控的分子机制。取得的主要研究结果如下:基因组分析表明,固氮施氏假单胞菌A1501拥有一个与铜绿假单胞菌crc高度同源的基因,氨基酸序列一致性达88%。通过三亲结合的方法构建了crc基因的缺失突变株。突变株在LB及A15限制培养基都能正常生长。当葡萄糖与苯甲酸同时存在时,突变株中葡萄糖抑制苯甲酸的能力下降。实时定量RT-PCR证明,在混合碳源培养条件下,突变株中苯甲酸和邻苯二酚降解的关键基因benA和catB相比野生型分别上调50和25倍,说明Crc影响了混合碳源中的芳香族化合物的降解,表现出碳代谢物抑制的调控功能。Biolog实验表明突变株对α-D-葡萄糖和葡萄糖酸等碳源的利用能力显著增强。此外,我们还发现Crc的突变影响了细菌的趋化能力,说明A1501中Crc的功能是多样的,除了影响碳源利用外,还对其他的某些途径存在着调节作用。与野生型相比,突变株的固氮酶活降低了30%。RT-PCR结果显示固氮条件下突变株中固氮酶结构基因nifH的表达量下调了30多倍。进一步实验构建了nifH基因的启动子与lacZ的融合载体,并检测报告基因lacZ的表达活性,结果表明,固氮条件下突变株中nifH基因的启动子活性只有野生型菌中的1/5到1/3。以上结果提示我们,在固氮施氏假单胞菌A1501菌中Crc可能通过某种尚未发现的方式影响了固氮基因的表达,这个现象在其他微生物中从未报道。为了研究Crc在固氮条件下的全局性调控机制,通过高通量测序手段对野生型和突变株在固氮条件下的转录组进行了测定。转录组分析表明crc突变株与野生型相比共有498个基因转录表现出显著差异(变化倍数大于2),其中108个基因表达明显上调,而390个基因的表达受到显著抑制,表明这些基因受crc的直接或间接影响。变化最明显的基因主要是与能量产生及转换相关的基因,碳源转运及代谢相关基因,氨基酸转运及代谢基因以及无机离子代谢及转运的相关基因等。转录组分析发现A1501固氮岛内59个固氮基因中有51个发生显著下调,此外,参与氮代谢调控的关键基因glnK,amtB等也表达下调,这表明Crc可能通过某种直接或者间接的机制影响了氮代谢,进而对固氮基因的表达产生影响,表现出酶活下降的表型。采用大肠杆菌BL21 (DE3)菌株表达了Crc蛋白,该蛋白分子量约30kDa,可用于下一步的Crc与调控靶标的分子互作研究。上述研究成果将为固氮微生物的碳代谢物抑制调控机制及碳氮偶联调控网络的揭示奠定重要的理论基础。