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哈茨木霉是一种重要的生物防治真菌,能拮抗多种植物病原菌如立枯丝核菌、齐整小核菌、尖孢镰孢菌、烟草疫霉等。在哈茨木霉拮抗病原菌的过程中病原菌会产生物理或化学信号分子。这些信号分子与哈茨木霉上相应的信号分子受体结合使哈茨木霉上的受体激活。活化的受体会启动哈茨木霉细胞内多种信号传导途径从而使木霉发生一系列细胞功能的改变。小G蛋白耦联受体介导的信号转导是一种重要的信号转导途径。rac基因编码的RAC蛋白是小G蛋白超家族中Rho家族的成员。rac基因的功能在哺乳细胞中研究较深入但在丝状真菌中的研究相对较少。对该基因的深入研究有助于揭示木霉拮病原菌的分子机制,并为阐明哈茨木霉中小G蛋白耦联受体介导的信号转导通路奠定基础。本实验以与哈茨木霉亲缘关较近的绿木霉为模板,通过设计一系列半随机引物的方法成功获得了哈茨木霉rac基因编码区及其上下游的DNA序列共2741bp。其中哈茨木霉rac基因编码区上游序列782bp,rac基因编码区990bp,rac基因编码区下游序列969bp。比较哈茨木霉rac基因完整编码区DNA序列与该基因的cDNA序列发现该基因编码区含有五个内含子,且五个内含子均以GT起始以AG结尾。将rac基因编码区DNA序列与全基因组测序的绿木霉,深绿木霉,里氏木霉DNA序列进行序列比对发现该基因编码区的DNA序列与绿木霉部分DNA序列相似性最高。根据获得的rac基因编码区及其侧翼序列选择恰当的酶切位点构建了两种可以敲除哈茨木霉rac基因的质粒载体pPZPTtk8.10::rac::hyg1和pPZPTtk8.10::rac::hyg2。酶切鉴定结果和质粒测序结果都说明两种敲除质粒载体构建成功。利用根癌农杆菌介导的哈茨木霉遗传转化方法获得了一系列哈茨木霉转化子。通过正筛选和负筛选双重筛选,获得了敲除了rac基因的哈茨木霉突变菌株。