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食管癌是一种复杂、侵袭性强的消化道恶性肿瘤疾病，发病率全球排名第九，致死率全球排名第七。植物化学物质是天然的植物源化合物，可用于治疗各种疾病，包括恶性肿瘤。稀有人参皂苷，是一种由三萜皂苷元和不同种类的糖苷通过糖苷键形成的四环三萜类化合物，具有优良的药理学功效。然而，稀有人参皂苷因为在人参中的含量很少，分离纯化工艺复杂，有关稀有人参皂苷Rh4抗食管癌作用及其机制的报道很少。为了阐明人参皂苷Rh4的抗肿瘤作用，本研究探究人参皂苷Rh4的制备及其抑制食管癌的作用机制。主要研究结果如下：
1.使用大孔吸附树脂和高效液相色谱分离纯化三醇组人参皂苷，并采用薄层层析法和高效液相色谱法对分离出的三醇组皂苷进行检测鉴定。工艺条件优化结果显示：当乙醇浓度为60~70%时，薄层层析法和高效液相色谱法分析洗脱液的分离与纯化效果最好。制备色谱柱梯度洗脱纯化可得到纯度为98.8%人参皂苷Rh4。
2.使用MTT实验和集落形成实验分别研究人参皂苷Rh4对食管癌细胞(Eca109、KYSE150)和正常人食管上皮细胞(HET-1A)的生长抑制作用和细胞克隆形成能力的影响。结果显示：人参皂苷Rh4能显著抑制食管癌的生长且对正常的食管上皮细胞具有低毒性。
3.建立食管癌Eca109细胞肿瘤裸鼠模型，探究人参皂苷Rh4对食管癌体内的抑制作用。裸鼠腹腔给药28天，记录裸鼠肿瘤的重量和尺寸，观察人参皂苷Rh4对裸鼠肿瘤的抑制作用。同时，通过H&E探索人参皂苷Rh4对主要器官的病理学影响。结果显示：人参皂苷Rh4可以显著抑制裸鼠肿瘤生长且对裸鼠主要器官无毒副作用。
4.通过细胞周期分布、葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP产量、细胞外酸化速率(ECAR)、增加耗氧量(OCR)和超氧负离子等实验，探究人参皂苷Rh4对食管癌细胞周期分布以及糖酵解水平影响。结果显示：人参皂苷Rh4能阻滞食管癌细胞Eca109和KYSE150于G1期。在食管癌细胞有氧糖酵解过程中，人参皂苷Rh4通过抑制乳酸的产生、葡萄糖的摄取、ATP的产生和细胞外酸化速率(ECAR)来抑制食管癌细胞的有氧糖酵解。
5.通过蛋白免疫印迹、qRT-PCR、免疫组化、免疫荧光、转染实验探究人参皂苷Rh4抑制有氧糖酵解的作用机制。结果显示：人参皂苷Rh4通过作用于AKT抑制食管癌的有氧糖酵解。AKT激动剂Insulin减弱了人参皂苷Rh4诱导的糖酵解水平。相反，AKT抑制剂或siRNA沉默AKT可进一步增强Rh4对需氧糖酵解的抑制作用。此外，分子对接结果进一步表明，Rh4能够与AKT的中间区域结合。
综上，本研究阐明了Rh4通过靶向AKT抑制食管癌好氧糖酵解，从而起到抑制肿瘤增殖的作用，为Rh4进一步开发为临床治疗药物奠定理论基础。
1.使用大孔吸附树脂和高效液相色谱分离纯化三醇组人参皂苷，并采用薄层层析法和高效液相色谱法对分离出的三醇组皂苷进行检测鉴定。工艺条件优化结果显示：当乙醇浓度为60~70%时，薄层层析法和高效液相色谱法分析洗脱液的分离与纯化效果最好。制备色谱柱梯度洗脱纯化可得到纯度为98.8%人参皂苷Rh4。
2.使用MTT实验和集落形成实验分别研究人参皂苷Rh4对食管癌细胞(Eca109、KYSE150)和正常人食管上皮细胞(HET-1A)的生长抑制作用和细胞克隆形成能力的影响。结果显示：人参皂苷Rh4能显著抑制食管癌的生长且对正常的食管上皮细胞具有低毒性。
3.建立食管癌Eca109细胞肿瘤裸鼠模型，探究人参皂苷Rh4对食管癌体内的抑制作用。裸鼠腹腔给药28天，记录裸鼠肿瘤的重量和尺寸，观察人参皂苷Rh4对裸鼠肿瘤的抑制作用。同时，通过H&E探索人参皂苷Rh4对主要器官的病理学影响。结果显示：人参皂苷Rh4可以显著抑制裸鼠肿瘤生长且对裸鼠主要器官无毒副作用。
4.通过细胞周期分布、葡萄糖摄取、乳酸产生、ATP产量、细胞外酸化速率(ECAR)、增加耗氧量(OCR)和超氧负离子等实验，探究人参皂苷Rh4对食管癌细胞周期分布以及糖酵解水平影响。结果显示：人参皂苷Rh4能阻滞食管癌细胞Eca109和KYSE150于G1期。在食管癌细胞有氧糖酵解过程中，人参皂苷Rh4通过抑制乳酸的产生、葡萄糖的摄取、ATP的产生和细胞外酸化速率(ECAR)来抑制食管癌细胞的有氧糖酵解。
5.通过蛋白免疫印迹、qRT-PCR、免疫组化、免疫荧光、转染实验探究人参皂苷Rh4抑制有氧糖酵解的作用机制。结果显示：人参皂苷Rh4通过作用于AKT抑制食管癌的有氧糖酵解。AKT激动剂Insulin减弱了人参皂苷Rh4诱导的糖酵解水平。相反，AKT抑制剂或siRNA沉默AKT可进一步增强Rh4对需氧糖酵解的抑制作用。此外，分子对接结果进一步表明，Rh4能够与AKT的中间区域结合。
综上，本研究阐明了Rh4通过靶向AKT抑制食管癌好氧糖酵解，从而起到抑制肿瘤增殖的作用，为Rh4进一步开发为临床治疗药物奠定理论基础。