论文部分内容阅读
喉气管瘢痕性狭窄切除后常遗留大段缺损，治疗棘手。近年来随着交通、工矿等事故增加，发病率有增加趋势。喉气管功能重建术关键要处理以下几个问题：1.喉气管黏膜上皮再生与修复；2.如何控制瘢痕增生；3.喉气管软骨支架修复；4.组织工程软骨构建研究。
严重的喉气管狭窄重建喉气管软骨支架、增宽喉气管腔是成功的关键。重建支架有自体组织，同种异体材料、合成材料等。自体组织有肋软骨、鼻中隔软骨、舌骨、旋转带状肌皮瓣、胸锁乳突肌锁骨膜瓣等，是临床应用最多、安全、有效的材料。主要缺点是增加供区创伤，取材有限，增加病人痛苦。因此应用替代材料的研究前景广阔。同种异体材料优点是材料来源广泛，主要需解决的问题有：①如何保存材料的活性。②如何解决免疫排斥反应。我科既往实验用组织培养RPMI-1640保存软骨180天仍保有较好活性，软骨细胞活性率保持在90％以上。用此培养的软骨进行同种异体移植能修复甲状软骨缺损。
Surgisis(Cook)是一种已商品化的无细胞的细胞外基质，一般取自猪小肠黏膜下层(smallintestinalsubmucosa，SIS)，已广泛应用于临床的胸腹壁、膈疝、骨盆底及膀胱壁缺损的修复[1,2]，并有人将其应用于兔气管的致命性狭窄修复，发现有纤毛柱状上皮附着于SIS补片表面[3]。
近年来，组织工程化气管的研究日益受到重视，要创造一个有活性的组织工程气管替代物，具有气管上皮的功能，尤其是纤毛运输固体颗粒和液体的能力，是气管重建中必须考虑的问题，但到目前为止，该问题尚未得到有效的解决。因此，研究建立气管纤毛上皮细胞体外培养模型使其成为组织工程气管种子细胞具有重要的临床意义。呼吸道上皮培养技术国外已发展多年，因其生长条件苛刻，国内研究较少，且培养技术尚不成熟。
本研究自制兔SIS，观察其生物相容性，评估自制SIS复合不同的经组织培养的异体软骨修复大块气管前壁缺损的可能性，并初步探索在现有实验条件下的气管纤毛上皮细胞培养。
目的1.比较两种制备方法所获兔小肠黏膜下层(SIS)的异同，为将SIS作为组织工程细胞载体选择最佳制备方案；通过SIS与软骨细胞共培养，观察软骨细胞在SIS上的生长特性，为使SIS作为软骨组织工程化的载体打下基础。
2.评估小肠黏膜下层复合不同的经组织培养的异体软骨修复大块气管前壁缺损的可能性。
3.探讨建立兔气管纤毛上皮细胞原代培养模型，观察其体外培养条件下的生物学特性。
方法1.小肠黏膜下层制备及其与软骨细胞共培养的实验研究分别用消毒法和顺序化学脱细胞法处理机械剥离获取的兔小肠黏膜下层，进行组织学、扫描电镜检查及MTT(四氮唑盐)细胞毒性对比实验。将不同浓度的兔软骨细胞与SIS进行体外复合培养，分别进行组织学、倒置显微镜和扫描电镜观察。
2.小肠黏膜下层复合软骨修复气管前壁缺损的实验研究取成年新西兰兔，行气管前壁4至6环全层缺损造模(缺损4mm×8mm约占气管环1/3)。取自制的小肠黏膜下层8片，分别包裹经组织培养的异体甲状软骨(实验组1)、耳廓软骨(实验组2)及单纯小肠黏膜下层(实验组3)修整为5mm×9mm，用4-0无损伤缝线间断缝合至气管缺损封闭缺损。对照组缺损用气管前筋膜封闭。对所有动物进行观察，出现严重呼吸困难或生存至4周及12周时处死并切取气管行常规病理检查。
3.兔气管黏膜上皮细胞培养及其生物学特性利用低温酶消化法分离获取兔气管纤毛上皮细胞，无血清生长因子培养基体外培养，倒置显微镜动态观察细胞生长情况，抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色及扫描电镜验证纤毛上皮细胞特性。
结果1.小肠黏膜下层制备及其与软骨细胞共培养的实验研究组织学及电镜扫描显示：与消毒法相比，经顺序化学浸泡脱细胞处理的SIS纯度高，孔隙多，安全性高，胶原纤维未受损；浸提液MTT检测各实验组相对增殖率均大于1，100％SIS浸提液各组与对照组吸光值均有显著性差异(P≤0.01)，相同浓度不同SIS浸提液组间无显著性差异，表明多种化学试剂的SIS对软骨细胞不增加毒性，有一定促生长作用；软骨细胞在SIS材料上生长、黏附、增殖，并能长入材料的孔隙内，分泌大量的细胞外基质成分。
2.小肠黏膜下层复合软骨修复气管前壁缺损的实验研究所有动物未出现手术意外，但实验组1(n=5)中的两只、实验组2(n=5)中的三只及实验组3(n=5)中的三只在术后出现进行性喘鸣存活不到一月并有不同程度的气管腔阻塞。实验组的其它动物和对照组(n=3)均存活超过一月，病理切片显示SIS修复的缺损被覆纤毛上皮细胞，移植的异体软骨有不同程度降解。
3.兔气管黏膜上皮细胞培养及其生物学特性所获细胞圆形，较大，悬浮旋转；接种24h后贴壁，6～8天联结成片，细胞形态多样，部分细胞可见纤毛活动，抗角蛋白单克隆抗体免疫组织化学染色阳性，扫描电镜下见气管上皮细胞特征。
结论1.化学脱细胞法较消毒法制备的SIS的安全性好，易保存，操作性强，所得SIS是一种较理想的软骨细胞载体，其细胞相容性良好，不影响软骨细胞的形态，对细胞生长和功能表达无抑制作用，是一种较理想的软骨细胞载体。
2.SIS及其与经组织培养的异体软骨复合物可以应用于兔气管前壁大块缺损的修复，SIS有利于缺损修复的再血管化及再上皮化，但其远期疗效尚有待进一步研究及改进。
3.酶消化法分离、无血清生长因子培养基培养的单层气管上皮细胞显示有一定的增殖能力，建立的兔气管纤毛上皮细胞的原代培养模型对培养气管组织工程种子细胞的具有一定的应用价值，但尚不能满足气管重建实验的要求。