论文部分内容阅读
肌质网Ca2+-ATPase是负责调节胞内Ca2+浓度的一种非常重要的酶。本篇论文围绕脂筏和神经节苷脂对肌质网Ca2+-ATPase活性调节的问题，进行了研究。分为三部分：1.从兔骨骼肌中通过差速离心和高离子强度抽提的方法得到肌质网囊泡，经形态、性质及功能的检测，证明得到的肌质网囊泡是封闭的，基本无质膜和线粒体等细胞器的污染，并且具有Ca2+依赖的ATP水解活性，及转运Ca2+的能力，同时也具有被肌质网Ca2+-ATPase的特异抑制剂---Thapsigargin抑制的特点，表明得到的肌质网囊泡不仅具有生理功能，而且还有较高的纯度，为进一步研究提供了良好的实验材料。
2.脂筏结构不仅存在于质膜，在高尔基体、膜蛋白运输通路中的内质网囊泡膜中也有类似的结构微区。肌质网是骨骼肌细胞中特化的内质网，其功能主要在于维持胞内的Ca2+平衡。我们利用蔗糖密度梯度漂浮的方法，从基本上无质膜和线粒体等细胞器污染的肌质网膜中分离了低密度的，低温下不溶于非离子去垢剂TritonX-100的膜微区，即肌质网膜的不溶于去垢剂的组分---SRIC，并对其进行了性质的鉴定，发现它富含鞘磷脂和胆固醇，并富集脂筏的标志分子GM1。Caveolin-3(Cav-3)是Caveolae的结构和标志蛋白，定位于肌细胞的质膜。我们利用免疫荧光显微镜技术，证明Cav-3也存在于肌质网膜上。另外免疫印迹的结果显示Cav-3在SRIC微区中富集。上述结果进一步提示肌质网膜中可能也具有“脂筏”结构。
对肌质网Ca2+-ATPase蛋白及其活性在膜上的分布情况进行了分析，肌质网Ca2+-ATPase既存在于SRIC，又存在于肌质网膜的溶于去垢剂的组分，即SRSC微区中，但是只有位于SRIC中的肌质网Ca2+-ATPase才表现出很高的Ca2+依赖的ATP水解活性和Ca2+转运活性，这说明肌质网Ca2+-ATPase与SRIC的结合对于其功能活性是必需的。利用不同的去垢剂，CHAPS和OG溶解肌质网膜，不同去垢剂提取的SRIC结构组成并不等同，但均支持肌质网Ca2+-ATPase只有与SRIC结构结合，才具有功能活性。用MβCD去除肌质网膜的胆固醇，破坏了SRIC结构，使得分布于SRIC组分的肌质网Ca2+-ATPase移向SRSC，并导致酶活力的丧失。以上结果提示肌质网膜中的“脂筏”结构对Ca2+-ATPase活性的表现具有重要的作用。
3.在肌质网水平，研究了外源性神经节苷脂GM2对肌质网Ca2+-ATPase活力的影响。GM2能抑制肌质网Ca2+-ATPase的ATP水解和Ca2+转运活性，并且具有浓度依赖性。唾液酸对肌质网Ca2+-ATPase的活性没有影响，表明神经节苷脂GM2本身的分子结构而非其酸性的化学性质对肌质网Ca2+-ATPase的调控起重要作用。将GM2处理的样品用1％TritonX-100处理，经蔗糖密度梯度离心后，分析GM2和肌质网Ca2+-ATPase在各组分的分布。实验结果表明大量GM2聚积在SRIC微区，并使肌质网Ca2+-ATPase从SRIC组分移出，导致了酶活力的抑制。上述结果为解析GM2储积病(如Sandhoff病)病变的分子机理—GM2抑制脑微粒体Ca2+-ATPase活性的研究提供了有意义的资料。