论文部分内容阅读
蜂毒素(Melittin)是欧洲蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒中的主要成分之一,约占蜜蜂毒液干重的40%~50%.该研究所要达到的预期目的就是通过改造蜂毒素的个别氨基酸组份,在保留其抗菌功能的前提下,降低溶血活性.该实验的主要内容及结果如下:1、蜂毒素分子结构的改造与设计:根据检索GeneBank得到蜂毒素氨基酸序列,推导出蜂毒素基因的全长序列.2、改造后蜂毒素基因的合成:该实验采用酶促方法合成蜂毒素基因,首先合成末端之间有21个互补碱基的两条寡核苷酸片段M1和M2,然后在PCR扩增仪上退火,以重叠区作为引物,在四种dNTP存在的条件下,通过Taq DNA聚合酶的作用,获得一条完整无酶切位点的蜂毒素基因.再通过两条带有酶切位点的短引物MP1和MP2扩增后引入酶切位点.合成的蜂毒素基因在5端引入了EcoR Ⅰ酶切位点,在3,端引入了SalⅠ酶切位点,以便于克隆到表达载体上.3、改造后蜂毒素基因在Pichia pastoris中的表达:把设计合成的蜂毒素基因经过双酶切后与载体pPICZ α-A连接,连接产物通过热激法转化到E.coliDH5 α中,在含25μg/mL Zeocin的低盐LB平板上筛选阳性单菌落,经酶切、PCR、测序确认.获得的含蜂毒素基因的重组表达载体大量扩增,抽提质粒,通过电击激法转化到Pichia pastoris宿主菌GS115中,在含100μg/mL Zeocin的YEPD平板上筛选阳性单菌落,经PCR确认,琼脂糖扩散法生物活性鉴定,Tricine-SDS-PAGE小分子量蛋白电泳分析,证实蜂毒素基因已整合到Pichia pastoris基因组DNA上,表达产物经α-factor信号肽引导分泌到培养基中,由Bradford法测定蜂毒素的表达量为293.184μg/ml左右.4、表达蜂毒素多肽的条件优化:将确定有外源蜂毒素基因插入的重组酵母菌培养后做为种子液,对Pichia pastoris GS115表达外源蛋白的最佳条件进行了摸索.利用不同的组合分别对酵母培养基甘油含量,培养基pH值,重组酵母菌诱导前培养时间,重组酵母菌甲醇诱导量,重组酵母菌诱导后培养时间进行了比较实验.最终得到了在实验室条件下小量培养的最适培养条件,为后期发酵罐扩大培养条件优化,生物活性分析打下了基础.5、表达蜂毒素多肽的生物活性鉴定:在确定最优培养表达条件之后,对Pichiapastoris表达的蜂毒素多肽进行了抑菌活性、溶血活性、热稳定性及酸碱条件下活性稳定性的实验.实验证实了经改造后表达的蜂毒素多肽具有良好的抑菌活性、一定范围内的热稳定性和酸、碱条件下的活性稳定性;而改造后表达的蜂毒素多肽的溶血活性与粗蜂毒及其纯化产物的溶血活性相比有较显著的降低,大约降低20倍.