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目的： 我国是世界上地方性氟中毒和砷中毒发病最广、病情最重的国家之一。饮水型氟中毒和砷中毒病区，是我国这两种地方病最主要的病区类型。近年发现我国山西、新疆、内蒙等地存在饮水型氟砷联合中毒的病区，高氟与高砷并存，增加了对人群健康影响的复杂性，对病区儿童生长发育、智力的影响已引起广泛关注。 研究表明过量氟、砷均可通过胎盘屏障或血脑屏障而在脑组织中蓄积，影响儿童不同时期的脑发育和神经递质的合成与分泌、神经信息的传递，从而损伤儿童智力和学习记忆能力。来自世界不同氟中毒、砷中毒病区的流行病学研究发现儿童长期饮用高氟水或高砷水可引起智力下降，损害学习记忆能力，同时也发现高砷高氟并存病区儿童的生长发育和智力受到一定程度的损害。但到目前为止，氟、砷损害学习记忆的分子机制尚未阐明。本研究以与学习记忆密切相关的海马、大脑皮质组织为靶点，研究氟、砷及其联合暴露对学习记忆功能、海马和大脑皮质神经细胞氧化应激和凋亡的影响，同时对海马、大脑皮质组织一氧化氮(nitricoxide，NO)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)，谷氨酸(glutamate，Glu)及其Ⅰ组代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptors，mGluRs)的基因和蛋白表达水平进行检测分析，探讨氟、砷及联合作用损害学习记忆的分子机制，揭示氟与砷的交互作用方式，为氟、砷及其联合中毒的防治提供理论依据和新思路。 实验方法： 一、实验动物与分组 健康、初断乳SPF级Sprague-Dawley大鼠96只，雌:雄为1∶1，体重50～70g。标准啮齿类动物饲料喂养，保持室温(24±1)℃，相对湿度在50-65％，自由饮食。适应性喂养观察1周后，将大鼠随机分为对照组、氟处理组、砷处理组和氟砷联合组，每组24只，雌雄各半。氟处理组大鼠自由饮用120 mg/L氟化钠(NaF)水溶液;砷处理组大鼠自由饮用70 mg/L亚砷酸钠(NaAsO2)水溶液;氟砷联合组大鼠自由饮用120 mg/L NaF和70 mg/L NaAsO2的混合水溶液;对照组大鼠自由饮用蒸馏水。各组染毒时间均为3个月，染毒期间四组大鼠均自由饮水、正常摄食。染毒期满后进行学习记忆能力测试。测试结束后处死动物，组织取材。 二、研究内容和方法 （一）各组大鼠血液、海马和大脑皮质组织氟和砷含量测定 分别采用酶标仪-氟试剂分光光度法和氢化物原子荧光光度法检测血液、海马和大脑皮质组织中氟和砷含量。 （二）各组大鼠海马和大脑皮质组织神经元超微结构的变化 常规制做电镜标本，在透射电子显微镜下观察氟、砷及其联合染毒大鼠海马、大脑皮质神经细胞超微结构的变化。 （三）各组大鼠学习记忆功能的评价 采用旷场试验和Morris水迷宫评价大鼠学习记忆能力。 （四）各组大鼠血清、海马和大脑皮质组织氧化损伤的检测 制备10％的海马和大脑皮质组织匀浆，按照试剂盒说明检测大鼠血清、海马、大脑皮质神经组织总抗氧化能力(T-AOC)、SOD酶和GSH-Px酶活力和MDA水平。 （五）各组大鼠血清、海马和大脑皮质神经细胞凋亡的检测 提取海马、大脑皮质组织总蛋白，采用Western blot方法检测Caspase-3、B细胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma2，Bcl-2）和Bcl-2相关的Ⅹ蛋白(Bcl-2 associatedⅩ protein，Bax)蛋白表达。 （六）各组大鼠血清、海马和大脑皮质组织NO和NOS酶活力、谷氨酸水平的检测 制备10％的海马和大脑皮质组织匀浆，按照试剂盒说明检测大鼠血清、海马、大脑皮质神经组织一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)的活力和谷氨酸(Glu)水平。 （七）各组大鼠海马和大脑皮质组织Ⅰ组mGluRs受体亚基mRNA和蛋白质表达检测 提取组织总RNA，采用Reverse Transcription-PCR(RT-PCR)法检测氟、砷及其联合暴露对大鼠脑组织mGluR1和mGluR5基因表达的影响。提取组织总蛋白，采用Western blot法检测氟、砷及其联合暴露对大鼠脑组织mGluR1和mGluR5蛋白表达的影响。 （八）统计学处理 实验结果以(x)±s表示。对于不呈现正态分布和方差不齐的数据经对数转换或取倒数后使其正态和方差齐。运用SAS8.2(SAS Institute Inc.，Cary，NC，USA)软件进行统计分析。两组均数的比较采用t检验，多组均数间的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD方法。 结果： 一、大鼠血液、海马和大脑皮质组织氟和砷含量测定 氟处理组和氟砷联合组大鼠血清、海马和大脑皮质组织氟含量均明显高于对照组和砷处理组（P均＜0.01）。砷处理组和氟砷联合组大鼠血液、海马和大脑皮质组织砷含量均明显高于对照组和氟处理组（P均＜0.01）。四组大鼠海马和大脑皮质组织的氟、砷含量差异均无统计学意义。 二、氟、砷及其联合染毒大鼠海马和大脑皮质神经元超微结构的变化 对照组大鼠海马和大脑皮质神经元细胞核膜清晰完整，核内异染色质及常染色质分布正常，核周线粒体等细胞器形态正常;突触前膜、后膜、突触间隙结构正常，胞浆内突触小泡，线粒体内嵴结构完整，微管及微丝正常可见。氟、砷及其联合染毒大鼠海马和大脑皮质神经元细胞均发生了程度不等的病理变化，主要表现在细胞皱缩，核变形，核周部分线粒体肿胀、空化、脊减少或消失，粗面内质网扩大呈池状;突触前膜胞浆内突触小泡，线粒体嵴结构不完整，突触间隙扩大，突触后膜线粒体肿胀、空化等。 三、氟、砷及其联合染毒对大鼠学习记忆功能的影响 （一）氟、砷及其联合染毒对大鼠在新环境中探究行为的影响 氟砷联合组大鼠旷场试验总得分明显低于对照组、氟处理组和砷处理组，差异均有统计学意义（P均＜0.01）。氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠的中央格停留时间均明显高于对照组（P均＜0.01）。四组大鼠旷场试验修饰次数的差异无统计学意义（P＞0.05）。 （二）氟、砷及其联合染毒对大鼠空间学习记忆功能的影响 与对照组比较，氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠的Morris水迷宫逃逸潜伏期和首次达平台时间均明显升高（P均＜0.01），第三象限时间和穿越平台次数均明显降低（P均＜0.01）。这四个指标在氟、砷处理组和氟砷联合组两两组间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。 四、氟、砷及其联合染毒对大鼠血清、海马和大脑皮质组织氧化损伤的影响 （一）氟、砷及其联合染毒对总抗氧化能力(T-AOC)的影响 与对照组比较，氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠的血清、海马和大脑皮质组织T-AOC(total antioxidant capability，T-AOC)水平均显著降低;与砷处理组比，氟处理组和氟砷联合组大鼠的血清T-AOC水平较低，差异均具有统计学意义(P均＜0.01)。 （二）氟、砷及其联合染毒对总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力的影响 与对照组比较，砷处理组和氟砷联合组大鼠的血清T-SOD酶活力均明显降低（P均＜0.01），氟处理组大鼠的血清T-SOD酶活力较低，差异具有临界显著性（P=0.053）。四组大鼠海马组织T-SOD酶活力差异无统计学意义(P＞0.05)。与对照组、氟处理组和氟砷联合组比较，砷处理组大鼠大脑皮质T-SOD酶活力较低(P＜0.01, P＜0.05,P＜0.05)。 （三）氟、砷及其联合染毒对谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力的影响 与对照组比较，砷处理组和氟砷联合组大鼠的血清GSH-Px酶的活力均较低，差异均具有统计学意义（P均＜0.01）;与氟处理组比较，砷处理组和氟砷联合组大鼠的血清GSH-Px酶的活力均较低（P＜0.01和P＜0.05）。砷处理组大鼠的海马GSH-Px酶的活力低于对照组、氟处理组和氟砷联合组（P均＜0.01）。与对照组比较，氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠的大脑皮质GSH-Px酶的活力均较低(P＜0.05，P＜0.01和＜0.05)。 （四）氟、砷及其联合染毒对丙二醛(MDA)含量的影响 与对照组比较，氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠的血清MDA水平明显升高(P＜0.01，P＜0.05和P＜0.05)。氟砷联合组大鼠海马MDA水平明显高于对照组(P＜0.01)，氟处理组(P＜0.05)和砷处理组(P＜0.05)。氟处理组和氟砷联合组大鼠大脑皮质组织MDA含量均明显高于对照组;与砷处理组比较，氟处理组大鼠大脑皮质MDA水平较高(P＜0.05)。 五、氟、砷及其联合染毒对大鼠海马和大脑皮质神经细胞凋亡的影响 （一）氟、砷及其联合染毒对Caspase-3凋亡蛋白表达的影响 四组大鼠海马和大脑皮质组织Caspase-3蛋白表达均无统计学意义。 （二）氟、砷及其联合染毒对海马组织Bcl-2和Bax凋亡蛋白表达的影响 氟、砷处理组大鼠海马组织凋亡蛋白Bcl-2表达量均低于对照组，但差异均无统计学意义，而氟砷联合组大鼠凋亡蛋白Bcl-2表达量明显低于对照组、氟和砷处理组(P＜0.01，P＜0.01和＜0.05)。与对照组比较，氟、砷处理组和联合组大鼠海马组织凋亡蛋白Bax的表达均明显升高，氟砷联合组升高最明显(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01);砷处理组和氟砷联合组的Bax表达水平均高于氟处理组(P＜0.05和P＜0.01)。与对照组比较，氟、砷处理组和氟砷联合组凋亡蛋白Bcl-2/Bax的表达比值均明显降低，氟砷联合组降低最明显(P＜0.05，P＜0.01和P＜0.01)。 （三）氟、砷及其联合染毒对大脑皮质组织Bcl-2和Bax凋亡蛋白表达的影响 氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠大脑皮质组织Bcl-2蛋白表达均低于对照组，但差异均无统计学意义。与对照组比，氟、砷处理组和联合组大鼠大脑皮质组织Bax蛋白表达量均显著升高（P均＜0.05）。氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠的Bcl-2/Bax表达比值均明显低于对照组，尤以氟砷联合组最明显，差异均有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01和P＜0.01)。 六、氟、砷及其联合染毒对大鼠血清、海马和大脑皮质组织NO、NOS酶活力、Glu的影响 （一）氟、砷及其联合染毒对大鼠血清、海马和大脑皮质组织NO和NOS酶活力的影响 氟处理组和氟砷联合组大鼠血清NO水平均低于对照组(P＜0.05和P＜0.01)。与对照组比，氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠海马组织NO水平均明显降低(P＜0.01,P＜0.05和P＜0.05)。 氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠血清、海马NOS酶活力均明显低于对照组，差异均有统计学意义。砷处理组大鼠大脑皮质组织NOS酶活力明显低于对照组和氟砷联合组（P＜0.01和P＜0.05）。 （二）氟、砷及其联合染毒对大鼠血清、海马和大脑皮质组织Glu含量的影响 与对照组比，氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠血清、海马和大脑皮质组织Glu水平均明显降低，差异均有统计学意义。氟、砷处理组和氟砷联合组大鼠血清、海马和大脑皮质组织Glu水平两两组间的差异均无统计学意义。 七、氟、砷及其联合染毒对大鼠海马和大脑皮质组织Ⅰ组mGluRsmRNA和蛋白质表达的影响 与对照组比，砷处理组大鼠海马组织mGluR1 mRNA表达升高(P＜0.05)，而氟砷联合组大鼠海马mG1uR1 mRNA表达均明显低于氟、砷处理组(P＜0.05和P＜0.01)。与对照组比，砷处理组和氟砷联合组大鼠大脑皮质组织mGluR1 mRNA表达均显著升高（P均＜0.01），尤以氟砷联合组明显，且联合组mGluR1 mRNA表达显著高于氟、砷处理组(P＜0.01和P＜0.05)。 与对照组比，砷处理组、氟砷联合组大鼠海马mGluR5 mRNA表达显著降低(P＜0.05和P＜0.01);氟砷联合组大鼠海马组织mGluR5 mRNA表达显著低于氟处理组大鼠（P＜0.05）。与对照组比，氟、砷处理组大鼠大脑皮质组织mGluR5 mRNA表达均降低，但差异均无统计学意义，而氟砷联合组mGluR5 mRNA表达显著低于对照组、氟和砷处理组（P均＜0.01）。 氟砷联合组大鼠海马组织mGluR5蛋白质表达量明显低于对照组、氟处理组和砷处理组（P均＜0.01）。与对照组比，砷处理组和氟砷联合组大鼠大脑皮质mGluR5的蛋白表达量降低(P＜0.05和P＜0.01)。 结论： 1、慢性氟、砷及其联合暴露均可影响大鼠在新环境中的探究行为和认知能力，使大鼠学习和记忆的获取能力降低，损害大鼠的空间学习记忆能力。 2、慢性氟、砷及其联合暴露可引起大鼠海马、大脑皮质组织氧化性损伤，可能与氟、砷及其联合作用所致大鼠学习记忆损伤有关。 3、慢性氟、砷及其联合暴露均使大鼠海马和大脑皮质组织Bax凋亡蛋白表达上调，Bcl-2/Bax的表达比值降低;氟砷联合暴露下调Bcl-2蛋白表达的作用高于单独氟或砷暴露，氟与砷存在协同作用。氟、砷诱导Bax和Bcl-2凋亡蛋白的变化可能参与了氟砷损害学习记忆的分子机制。 4、慢性氟、砷及其联合暴露均可降低大鼠海马组织NO水平和NOS酶活力，而对大脑皮质组织NO水平没有影响。氟、砷降低脑组织NO水平和NOS酶活力可能是其损害学习记忆的分子机制之一。 5、慢性氟、砷及其联合暴露均可降低血清、海马和大脑皮质组织Glu水平。单独砷暴露使大鼠海马和大脑皮质组织mGluR1基因表达上调，海马组织mGluR5基因表达下调，大脑皮质组织mGluR5蛋白表达下调。氟与砷对大鼠大脑皮质组织mGluR1和mGluR5 mRNA表达、海马组织mGluR5 mRNA和蛋白表达的影响存在协同作用。