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研究背景:
肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)属于非小细胞肺癌，约占肺癌的40％，许多国家腺癌的发病率已超过鳞状细胞癌。远处转移是引起肺腺癌患者死亡的主要原因，因此了解转移的分子机制有助于提高肺癌的诊断和治疗水平。癌症转移的初级阶段多始于淋巴管。肿瘤能够释放细胞因子诱导淋巴管新生，使内皮细胞以出芽的方式生成新的淋巴管，利于肿瘤细胞逃脱原发肿瘤限制并经新生淋巴管转移扩散。尽管肿瘤生物学发展迅速，但是对淋巴侵袭和淋巴转移的分子机制知之甚少。
研究表明CD109在肺腺癌组织中表达上调，其过表达与肺腺癌进展、远处转移和预后不良明显正相关。然而CD109影响肿瘤淋巴管新生从而促进肿瘤细胞转移的分子机制有待进一步阐明。在本研究中，我们通过构建CD109过表达细胞模型证明了释放形式的CD109促进淋巴管内皮细胞的迁移。进一步探究作用机制，我们发现Jak/Stat3介导的信号通路可作为CD109的分子靶标诱导淋巴管内皮细胞的迁移。同时Hes家族是哺乳动物中唯一已知的Notch效应因子，分泌形式的CD109可能通过激活Notch信号调控Hes1的表达影响淋巴管内皮细胞的正常功能。虽然放疗和化疗在肺腺癌的早期治疗中均有疗效，但分子改变是导致肺腺癌耐药和远处转移的主要原因。以淋巴管新生信号通路为靶标能够为限制癌症的转移扩散提供有效的治疗策略。
第一部分:调控CD109表达对HDLEC细胞增殖、迁移的影响
研究目的:
调控肺腺癌细胞中CD109的表达，检测CD109在培养液中分泌情况并作用于淋巴管内皮细胞，探究其对HDLECs在功能学方面如增殖、迁移的影响。
研究方法:
1.CD109腺病毒表达载体的构建
采用吉凯公司制备和包装的CD109过表达腺病毒。
2.CD109在细胞中的表达及释放情况
2.1调控CD109表达，检测其在肺腺癌细胞中的表达情况
用上述包装好的腺病毒感染人肺腺癌细胞A549，分为阴性对照组(con)和实验组(CD109)。收集细胞蛋白质，通过蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测转染后细胞内CD109蛋白水平的表达情况;提取转染后A549细胞RNA，分别设计CD109和GAPDH的引物，通过实时荧光定量PCR技术(Real Time PCR)检测肺腺癌细胞CD109mRNA水平的表达情况。
2.2检测A549转染腺病毒后细胞释放CD109的情况
CD109能够从细胞表面释放进入周围培养液中，收集腺病毒转染后的A549上清条件条件培养液，分为阴性对照组Con-CM和实验组CD109-CM。利用WesternBlot实验检测条件培养液中CD109的分泌情况，以FLAG标签作为阳性对照，以考马斯亮蓝染色条带作为内参。
3.CD109对人真皮淋巴管内皮细胞(Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells,HDLECs)在功能学方面的影响
3.1建立共培养体系，检测CD109对HDLECs增殖能力的影响
将收集的A549细胞条件培养液作用于人真皮淋巴管内皮细胞，模拟HDLEC在肺腺癌中的微环境，建立共培养体系。利用MTT、CCK-8实验检测HDLEC增殖活力的变化。
3.2检测细胞释放形式的CD109对HDLEC迁移能力的影响
收集条件培养液，与HDLEC细胞建立共培养体系。通过细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验检测培养液中可溶性CD109对HDLECs迁移能力的影响。
研究结果:
1.成功构建CD109过表达腺病毒。
2.A549细胞转染腺病毒后与对照组相比，实验组细胞中CD109蛋白质表达水平和mRNA表达水平均明显升高，表明CD109过表达腺病毒成功转染进入细胞并表达;收集上清培养液，CD109-CM组CD109分子表达量显著升高，表明CD109能够从肺腺癌细胞表面释放进入周围环境，且细胞中CD109过表达导致释放形式的CD109相应增加。
3.MTT、CCK8研究结果表明，A549细胞分泌的CD109对HDLEC的增殖能力无影响;细胞划痕和Transwell迁移实验结果表明，与对照组相比，CD109-CM组HDLECs迁移面积和迁移数量明显增加，分泌性CD109可显著促进内皮细胞迁移但对其增殖水平没有影响。
研究结论:
肺腺癌细胞系A549能够从细胞表面释放CD109，作用于内皮细胞，促进内皮细胞的迁移，影响淋巴管新生，进而促进肿瘤经淋巴管远处转移。
第二部分:CD109作用于淋巴管内皮细胞的分子机制
研究目的:
研究CD109作用于HDLEC细胞调控其迁移能力的具体分子机制的，探讨CD109对内皮细胞功能的影响。
研究方法:
1.CD109对人真皮淋巴管内皮细胞中Jak/Stat3信号通路的影响
1.1CD109对HDLECs表达Jak和Stat3的影响
将上述条件培养液上清Con-CM和CD109-CM分别作用于淋巴管内皮细胞，利用WesternBlot实验检测收集的HDLECs中蛋白P-Jak2/Jak2和P-Stat3/Stat3蛋白表达水平，并计算其相应的磷酸化比例。分析肺腺癌细胞分泌的CD109对内皮细胞Jak和Stat3表达水平的影响。
1.2加入Stat3抑制剂(Stattic)，检测CD109对HDLEC迁移能力及Stat3分子表达的影响
为进一步验证CD109正向调控Stat3信号通路促进HDLECs迁移，本研究使用终浓度为20μmol的Stat3抑制剂(Stattic)作用于内皮细胞1h。收集细胞进行WesternBlot实验检测P-Stat3/Stat3蛋白表达水平;利用细胞划痕实验以及Transwell迁移实验比较两组处理中HDLECs迁移变化。
2.调控CD109表达，检测CD109对肺腺癌细胞及HDLECs中Notch-Hes1信号通路的影响
2.1CD109在肺腺癌细胞中对Notch-Hes1信号的调控
收集CD109腺病毒转染的A549肺腺癌细胞，通过WesternBlot实验和RT-PCR实验分析CD109对Hesl在蛋白和基因水平上表达的影响。
2.2CD109对内皮细胞Hes1表达的影响
收集经条件培养液处理24h后的HDLECs，进行WesternBlot实验和qPCR实验检测CD109作用于内皮细胞对Notch-Hes1信号通路的影响。
研究结果:
1.与对照组结果相比，CD109-CM组HDLECs中磷酸化的Jak2和Stat3水平均显著升高。加入Stattic后，消除了CD109诱导的内皮细胞迁移增加，同时原本由CD109诱导高表达的P-Stat3水平被降低。表明CD109通过正向调控Stat3信号通路促进内皮细胞的迁移。
2.与对照组比较，转染CD109过表达腺病毒组Hes1在A549和HDLECs细胞中表达明显升高，表明CD109能够激活Notch-Hes1信号通路。
研究结论:
A549细胞表面释放的CD109具有生物活性，通过诱导Jak/Stat3信号通路促进内皮细胞迁移，且分泌形式的CD109能够激活Notch信号。
肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)属于非小细胞肺癌，约占肺癌的40％，许多国家腺癌的发病率已超过鳞状细胞癌。远处转移是引起肺腺癌患者死亡的主要原因，因此了解转移的分子机制有助于提高肺癌的诊断和治疗水平。癌症转移的初级阶段多始于淋巴管。肿瘤能够释放细胞因子诱导淋巴管新生，使内皮细胞以出芽的方式生成新的淋巴管，利于肿瘤细胞逃脱原发肿瘤限制并经新生淋巴管转移扩散。尽管肿瘤生物学发展迅速，但是对淋巴侵袭和淋巴转移的分子机制知之甚少。
研究表明CD109在肺腺癌组织中表达上调，其过表达与肺腺癌进展、远处转移和预后不良明显正相关。然而CD109影响肿瘤淋巴管新生从而促进肿瘤细胞转移的分子机制有待进一步阐明。在本研究中，我们通过构建CD109过表达细胞模型证明了释放形式的CD109促进淋巴管内皮细胞的迁移。进一步探究作用机制，我们发现Jak/Stat3介导的信号通路可作为CD109的分子靶标诱导淋巴管内皮细胞的迁移。同时Hes家族是哺乳动物中唯一已知的Notch效应因子，分泌形式的CD109可能通过激活Notch信号调控Hes1的表达影响淋巴管内皮细胞的正常功能。虽然放疗和化疗在肺腺癌的早期治疗中均有疗效，但分子改变是导致肺腺癌耐药和远处转移的主要原因。以淋巴管新生信号通路为靶标能够为限制癌症的转移扩散提供有效的治疗策略。
第一部分:调控CD109表达对HDLEC细胞增殖、迁移的影响
研究目的:
调控肺腺癌细胞中CD109的表达，检测CD109在培养液中分泌情况并作用于淋巴管内皮细胞，探究其对HDLECs在功能学方面如增殖、迁移的影响。
研究方法:
1.CD109腺病毒表达载体的构建
采用吉凯公司制备和包装的CD109过表达腺病毒。
2.CD109在细胞中的表达及释放情况
2.1调控CD109表达，检测其在肺腺癌细胞中的表达情况
用上述包装好的腺病毒感染人肺腺癌细胞A549，分为阴性对照组(con)和实验组(CD109)。收集细胞蛋白质，通过蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测转染后细胞内CD109蛋白水平的表达情况;提取转染后A549细胞RNA，分别设计CD109和GAPDH的引物，通过实时荧光定量PCR技术(Real Time PCR)检测肺腺癌细胞CD109mRNA水平的表达情况。
2.2检测A549转染腺病毒后细胞释放CD109的情况
CD109能够从细胞表面释放进入周围培养液中，收集腺病毒转染后的A549上清条件条件培养液，分为阴性对照组Con-CM和实验组CD109-CM。利用WesternBlot实验检测条件培养液中CD109的分泌情况，以FLAG标签作为阳性对照，以考马斯亮蓝染色条带作为内参。
3.CD109对人真皮淋巴管内皮细胞(Human Dermal Lymphatic Endothelial Cells,HDLECs)在功能学方面的影响
3.1建立共培养体系，检测CD109对HDLECs增殖能力的影响
将收集的A549细胞条件培养液作用于人真皮淋巴管内皮细胞，模拟HDLEC在肺腺癌中的微环境，建立共培养体系。利用MTT、CCK-8实验检测HDLEC增殖活力的变化。
3.2检测细胞释放形式的CD109对HDLEC迁移能力的影响
收集条件培养液，与HDLEC细胞建立共培养体系。通过细胞划痕实验、Transwell细胞迁移实验检测培养液中可溶性CD109对HDLECs迁移能力的影响。
研究结果:
1.成功构建CD109过表达腺病毒。
2.A549细胞转染腺病毒后与对照组相比，实验组细胞中CD109蛋白质表达水平和mRNA表达水平均明显升高，表明CD109过表达腺病毒成功转染进入细胞并表达;收集上清培养液，CD109-CM组CD109分子表达量显著升高，表明CD109能够从肺腺癌细胞表面释放进入周围环境，且细胞中CD109过表达导致释放形式的CD109相应增加。
3.MTT、CCK8研究结果表明，A549细胞分泌的CD109对HDLEC的增殖能力无影响;细胞划痕和Transwell迁移实验结果表明，与对照组相比，CD109-CM组HDLECs迁移面积和迁移数量明显增加，分泌性CD109可显著促进内皮细胞迁移但对其增殖水平没有影响。
研究结论:
肺腺癌细胞系A549能够从细胞表面释放CD109，作用于内皮细胞，促进内皮细胞的迁移，影响淋巴管新生，进而促进肿瘤经淋巴管远处转移。
第二部分:CD109作用于淋巴管内皮细胞的分子机制
研究目的:
研究CD109作用于HDLEC细胞调控其迁移能力的具体分子机制的，探讨CD109对内皮细胞功能的影响。
研究方法:
1.CD109对人真皮淋巴管内皮细胞中Jak/Stat3信号通路的影响
1.1CD109对HDLECs表达Jak和Stat3的影响
将上述条件培养液上清Con-CM和CD109-CM分别作用于淋巴管内皮细胞，利用WesternBlot实验检测收集的HDLECs中蛋白P-Jak2/Jak2和P-Stat3/Stat3蛋白表达水平，并计算其相应的磷酸化比例。分析肺腺癌细胞分泌的CD109对内皮细胞Jak和Stat3表达水平的影响。
1.2加入Stat3抑制剂(Stattic)，检测CD109对HDLEC迁移能力及Stat3分子表达的影响
为进一步验证CD109正向调控Stat3信号通路促进HDLECs迁移，本研究使用终浓度为20μmol的Stat3抑制剂(Stattic)作用于内皮细胞1h。收集细胞进行WesternBlot实验检测P-Stat3/Stat3蛋白表达水平;利用细胞划痕实验以及Transwell迁移实验比较两组处理中HDLECs迁移变化。
2.调控CD109表达，检测CD109对肺腺癌细胞及HDLECs中Notch-Hes1信号通路的影响
2.1CD109在肺腺癌细胞中对Notch-Hes1信号的调控
收集CD109腺病毒转染的A549肺腺癌细胞，通过WesternBlot实验和RT-PCR实验分析CD109对Hesl在蛋白和基因水平上表达的影响。
2.2CD109对内皮细胞Hes1表达的影响
收集经条件培养液处理24h后的HDLECs，进行WesternBlot实验和qPCR实验检测CD109作用于内皮细胞对Notch-Hes1信号通路的影响。
研究结果:
1.与对照组结果相比，CD109-CM组HDLECs中磷酸化的Jak2和Stat3水平均显著升高。加入Stattic后，消除了CD109诱导的内皮细胞迁移增加，同时原本由CD109诱导高表达的P-Stat3水平被降低。表明CD109通过正向调控Stat3信号通路促进内皮细胞的迁移。
2.与对照组比较，转染CD109过表达腺病毒组Hes1在A549和HDLECs细胞中表达明显升高，表明CD109能够激活Notch-Hes1信号通路。
研究结论:
A549细胞表面释放的CD109具有生物活性，通过诱导Jak/Stat3信号通路促进内皮细胞迁移，且分泌形式的CD109能够激活Notch信号。