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糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病主要血管并发症之一，已成为世界性主要致盲眼病。糖尿病及其并发症的发病机理，目前仍不明确。比较公认的机理主要有：增强的多元醇途径、糖基化终产物的增多、蛋白激酶C途径的激活及经氨基己糖途径葡萄糖内流增多。有研究表明，高糖诱导的线粒体内活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)等自由基过量产生和氧化应激形成，是激活上述发病途径的关键点，已成为糖尿病并发症发生发展过程中的中枢性事件。基于该理论，目前针对自由基清除的防治策略主要为各种酶类及非酶类抗氧化剂的应用，但由于源头性病因尚不清楚，疗效欠佳。线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)损伤导致编码的呼吸链重要蛋白表达缺陷，进而ROS产生增多，最终导致mtDNA氧化损伤恶性循环的激发。
为探讨糖尿病视网膜病变发病机制，阐明mtDNA损伤-ROS产生-mtDNA损伤恶性循环对线粒体、细胞功能障碍的影响，我们应用糖尿病大鼠模型及体外培养的人视网膜血管内皮细胞，观察mtDNA损伤及其编码基因的表达情况，探讨mtDNA损伤与ROS产生、线粒体失调及细胞功能障碍之间的关系。旨在进一步深化糖尿病视网膜病变发病机制的研究，为其临床防治提供新思路和治疗靶标。
目的：观察糖尿病大鼠视网膜血管细胞mtDNA损伤及粘附分子表达、细胞凋亡产生情况，阐明糖尿病视网膜病变中血管细胞mtDNA损伤的存在及其与细胞功能障碍的关系。
方法：应用链尿佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠模型，以造模成功后1月、2月、3月大鼠为DR1m组、DR2m组、DR3m组，各时间点设年龄相匹配的正常大鼠为对照，即NR1m组、NR2m组、NR3m组。提取各组大鼠视网膜血管DNA后，联合Fpg酶切Southern blot定量检测未损伤mtDNA含量；提取RNA行RT-PCR观察mtDNA编码基因COX1及转录调控基因mtTFA mRNA的表达；消化铺片后TUNNEL免疫荧光、ICAM-1免疫组化染色，观察细胞凋亡及粘附分子的表达。
结果：DR1m、DR2m、DR3m组大鼠分别与NR1m、NR2m、NR3m组大鼠相比，未损伤mtDNA含量明显减少，且随着时间的延长，减少更明显；COX1及mtTFA mRNA表达相应降低；TUNNEL(除DR1m组外)、ICAM-1阳性细胞数增多，且着染更深。
结论：糖尿病大鼠随着病程延长，视网膜血管病变产生，mtDNA损伤加重，其编码基因及转录调控基因mRNA的表达均相应下降，同时粘附分子表达上调，细胞凋亡逐渐出现。在糖尿病视网膜病变发生发展中，mtDNA损伤存在且逐渐加重，与编码基因mRNA表达下调、细胞功能障碍存在明显时间相关性，可能是导致血管功能障碍的原因之一。
目的：阐明糖尿病视网膜病变发病中，mtDNA损伤与ROS产生、线粒体膜电位及细胞功能障碍之间的关系；探讨mtDNA损伤在糖尿病视网膜病变发病机制中的作用及可能机理。
方法：培养人视网膜血管内皮细胞，鉴定后随机分为N组、1hG组、3hG组、6hG组、12hG组、24hG组、48hG组。N组使用含5mM葡萄糖的正常HE-SFM培养液培养；其余各G组应用含30mM高浓度葡萄糖的HE-SFM培养基培养，在加入高糖培养基培养1h、3h、6h、12h、24h、48h后收集细胞。各组细胞提取DNA，联合Fpg酶切Southern blot定量检测mtDNA损伤；提取RNA后RT-PCR观察mtDNA编码基因COX1、NAD(P)H1及nDNA编码基因ATPsynβ mRNA的表达，同时观察粘附分子ICAM-1 mRNA的表达；应用JC-1荧光染料通过流式细胞仪检测线粒体膜电位变化；应用mitotracker／H2-DCF-DA荧光探针免疫荧光染色共定位，并通过激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体ROS产生；应用Annexin V／PI荧光染料通过流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。
结果：与N组相比，1hG组即观察到未损伤mtDNA的减少到85.5％；并且高糖干预时间越长，未损伤mtDNA越少，至高糖作用后6h，损伤明显加重。mtDNA编码基因NAD(P)H1、COX1 mRNA的表达下调，6hG组开始差异有统计学意义(p<0.05)，而nDNA编码基因mRNA的表达无改变。JC-1荧光红绿比值12hG、24hG、48hG组依次下降。ROS阳性细胞数12hG组后逐渐增加且染色更深。ICAM-1 mRNA表达相应增加，24hG、48hG组与N组相比差异均有统计学意义(p<0.05)。凋亡细胞百分率在24hG、48hG组显著增多。
结论：高浓度葡萄糖可诱导人视网膜血管内皮细胞功能障碍和线粒体功能障碍，表现为细胞凋亡、ICAM-1的mRNA表达上调和线粒体膜电位降低、呼吸链重要蛋白的表达缺陷等。高糖作用后短时间内即可存在明显的可检测的内皮细胞mtDNA氧化损伤及其编码基因mRNA表达下调(尽管nDNA在所观察的时间内尚未产生能检测到的损伤)；这可能影响线粒体功能，进一步导致ROS过量产生，并最终引起细胞功能障碍。mtDNA损伤-ROS产生-mtDNA损伤恶性循环可能在糖尿病视网膜病变起着激活和放大高血糖刺激信号的关键作用。
目的：观察mtDNA损伤修复对高糖诱导的人视网膜血管内皮细胞线粒体及细胞功能障碍的影响；探讨mtDNA损伤修复在糖尿病视网膜病变防治中的可行性，并进一步证实mtDNA损伤-ROS产生-mtDNA损伤恶性循环在糖尿病视网膜病变的发生发展中的关键作用。
方法：构建带线粒体靶向序列(Mitochondrial Target Serial，MTS)的mtDNA损伤修复酶hOGG1真核表达载体MTS-hOGG1-pcDNA3.1+，酶切鉴定并测序后，转染人视网膜血管内皮细胞，RT-PCR观察转染后hOGG1 mRNA表达。随机将人视网膜血管内皮细胞分为正常对照组(N)、高糖对照组(G)、hOGG1组(O)、Vector组(V)，应用JC-1荧光染料通过流式细胞仪检测线粒体膜电位变化；应用mitotracker／H2-DCF-DA荧光探针免疫荧光染色共定位，并通过激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体ROS生成；应用Annexin V／PI荧光染料通过流式细胞仪检测细胞凋亡的发生。
结果：成功构建带线粒体靶向序列MTS的mtDNA损伤修复酶hOGG1真核表达载体MTS-hOGG1-pcDNA3.1+，酶切和测序鉴定插入基因大小及序列正确。转染人视网膜血管内皮细胞后hOGG1 mRNA表达升高。O组线粒体膜电位较G组高，ROS染色细胞数更少且染色更浅，凋亡细胞百分率更低；而V组与G组无明显差异。
结论：线粒体靶向高表达mtDNA修复酶hOGG1后，有效抑制了高糖诱导的线粒体膜电位下降、ROS生成、细胞凋亡产生等线粒体及细胞功能障碍。mtDNA损伤修复能有效防止或减缓糖尿病视网膜病变微血管并发症的发生发展，mtDNA损伤-ROS产生-mtDNA损伤恶性循环在糖尿病视网膜病变中起着重要的病因性作用。