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脂代谢紊乱的主要形式是血浆脂蛋白代谢紊乱,可直接引起一些严重危害人体健康的疾病,如动脉粥样硬化相关的心脑血管疾病、肥胖症、脂肪肝等。硫化氢(H2S)是继一氧化氮和一氧化碳之后又一新的具有心血管调节功能的内源性气体信号分子。研究表明,硫化氢具有保护血管内皮、舒张血管平滑肌、抑制血管平滑肌细胞增殖、影响脂质代谢等抗动脉粥样硬化等心血管疾病的功能。人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9基因(PCSK9)是一种与调节脂质代谢密切相关的基因,PCSK9可通过调节细胞表面的低密度脂蛋白受体(LDLR)水平,参与脂质代谢。那么,H2S是否可能通过调节PCSK9表达,调节脂质代谢,进而起到抗动脉粥样硬化的作用。因此,本研究拟在讨论H2S对Hep G2细胞PCSK9表达的影响,并研究其作用机制,为研究降血脂药物提供新的干预靶点。第一部分:H2S对Hep G2细胞中PCSK9表达以及H2S对Hep G2细胞脂质摄取的影响。[目的]观察H2S能否通过调节PCSK9的表达影响Hep G2细胞的脂质摄取。[实验方法]分别用0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L的H2S供体Na HS处理Hep G2细胞24小时后,Western blot检测PCSK9的蛋白表达。用200μmol/LNa HS处理Hep G2细胞不同时间(0h、6h、12h、24h)后,Western blot检测PCSK9的蛋白表达。油红O染色和细胞膜红色荧光标记探针LDL(Di I-LDL)观察Hep G2细胞脂质摄取情况。用PCSK9 si RNA干扰PCSK9表达,Na HS处理Hep G2细胞24小时后,Di I-LDL观察Hep G2细胞脂质摄取情况。[结果]随着Na HS浓度的增高,Hep G2细胞中的PCSK9的蛋白表达和脂质摄取呈浓度依赖性的降低,其中200μmol/LNa HS处理组降低最为明显;与0h组相比,随着Na HS作用时间的延长,Hep G2细胞中的PCSK9的蛋白表达呈时间依赖性的下调,其中以24h降低最为显著。干扰了PCSK9后,PCSK9蛋白表达下降,部分恢复了Hep G2细胞脂质摄取。[小结]H2S呈浓度及时间依赖性下调Hep G2细胞中的PCSK9的蛋白表达,抑制Hep G2细胞脂质摄取。第二部分:H2S影响Hep G2细胞PCSK9表达的机制研究。[目的]探讨H2S调控Hep G2细胞PCSK9表达的分子机制。[实验方法]分别用0μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L Na HS处理Hep G2细胞24小时后,Western blot检测p-Akt、SREBP-1c、SREBP-2、LDLR的蛋白表达。用PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002对Hep G2细胞进行预处理,随后加入200μmol/L的Na HS处理Hep G2细胞24小时,Western blot检测p-Akt、SREBP-1c、SREBP-2、PCSK9、LDLR的蛋白表达。[结果]H2S能呈浓度依赖性上调Hep G2细胞中的p-Akt、SREBP-1c和LDLR的蛋白表达,下调Hep G2细胞中的SREBP-2的蛋白表达。给予LY294002预处理后,p-Akt、SREBP-1c、SREBP-2、PCSK9和LDLR的蛋白表达均降低。[小结]H2S通过激活PI3K/Akt信号通路,上调SREBP-1c的蛋白表达,进而上调LDLR的蛋白表达;H2S能够抑制SREBP-2的蛋白表达,进而下调PCSK9的蛋白表达,上调LDLR的蛋白表达。[结论]1.H2S能够通过下调PCSK9的表达调节Hep G2细胞的脂质蓄积;2.H2S通过激活PI3K/Akt信号通路,上调SREBP-1c的蛋白表达,进而上调LDLR的蛋白表达;H2S能够抑制SREBP-2的蛋白表达,进而下调PCSK9的蛋白表达,上调LDLR的蛋白表达。