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甲型肝炎病毒(以下简称甲肝病毒或HAV)属于小RNA病毒科肝炎病毒属，是甲型肝炎的致病因子，主要通过被污染的水和食物经粪口途径传播，人群普遍易感，每年甲型肝炎占我国急性病毒性肝炎的首位，是严重危害人民健康的疾病。甲肝病毒感染后虽不易引起慢性感染，但会给国家和个人造成巨大的经济损失，如1988年的上海甲肝大流行。
甲肝病毒是没有包膜的病毒颗粒，含有一个单股正链RNA，抗原结构保守。虽有不同的基因型，但只有一种血清型。目前有疫苗可以预防甲肝病毒的感染，但并没有纳入计划免疫，并且对甲肝病毒先期暴露后的感染无预防作用；而高效价人源免疫球蛋白作为一种被动免疫手段，在一旦有流行症状时使用，是一种有效的应急措施。但人源制品来源困难并且可能有病原微生物的污染，动物抗体因异种蛋白不宜应用。随着分子生物学和免疫学的发展，我们已经成功地从噬菌体抗体库中筛选获得了中和性人源抗甲肝病毒基因工程抗体基因，并分别在杆状病毒和CHO细胞表达系统中进行了IgG抗体的表达。
植物表达系统与大肠杆菌E.coli，酵母细胞，杆状病毒以及CHO细胞表达系统相比，具有许多优点：植物表达系统因其本身是自然界的一部分，参与自然界中的各种循环，可以大规模生产，成本低廉；有成熟的大量收获和加工植物及植物产品的现成技术，同时可最大程度地降低有可能影响人类健康的病原微生物或有毒物质的污染；具有真核基因表达调控及转录翻译加工的成套系统；另外某些植物可直接食用，可用于生产口服疫苗或药品从而降低了纯化的费用；外源蛋白在植物中表达后一般比较稳定，方便了产品的储藏和运输等等。目前已有多种形式的抗体在植物中进行了表达，包括scFv，Fab，IgG，IgA抗体等。
为建立新的抗体高效表达系统，完善抗体工程平台，为新型基因工程抗体药品的生产和制备提供实验基础，也为探索用植物中生产的抗体来纯化相应的抗原以及体外诊断的应用等打下基础，我们在植物中表达了多种形式的人源中和性抗甲肝病毒基因工程抗体，并对其生物学功能进行了比较分析。本论文主要由以下内容组成：
1在大肠杆菌E.coli中表达人源中和性抗甲肝病毒scFv抗体，并对其生物学特性进行鉴定。利用一株已筛选出的中和性人源抗甲肝病毒HAFc16IgG抗体基因经过PCR扩增和克隆，构建VH-linker-VL型单链抗体(scFvHA16)并在大肠杆菌中表达，经鉴定，表达抗体具有很好的与甲肝病毒抗原的结合活性。
2因为在植物中表达抗体耗时较长，我们首先在Pichiapastoris酵母中表达人源中和性抗甲肝病毒scFv-Fc融合抗体，并对其生物学特性进行鉴定。将上述的scFvHA16抗体基因克隆入含有人源Fc片段的酵母细胞表达载体pPiCZαFc中，得到融合抗体表达质粒pPiscFv-FcHA16，并在Pichiapastoris酵母中进行分泌表达，对表达产物进行了纯化。WesternBlot显示表达的蛋白带为具有不同糖基化形式的同源二聚体，ELISA以及体外中和实验表明表达的融合抗体仍保持了很好的生物学活性，与相应的CHO细胞中表达的CHOIgGHA16抗体相比，没有明显的区别。
3用双子叶植物种子储存蛋白特异性启动子Pfas构建了中和性人源抗甲肝病毒scFv-Fc融合抗体表达质粒patag6pfasscFv-FcHA16，同时还构建了另一株人源抗大肠杆菌麦芽糖结合蛋白MBP的融合抗体表达质粒pata6pfasscFv-FcMBP作为对照(此两个表达质粒均含有内质网定位信号KDEL)，并分别转化了拟楠芥植株。对拟楠芥转基因植株种子中表达蛋白的SDS-PAGE及WesternBlot分析表明，种子中表达的patag6pfasscFv-FcHA16融合抗体大部分降解了，分析表明这种降解是发生在植株体内而不是发生在抗体提取过程中；另一株对照抗体pata6pfasscFv-FcMBP则得到了很好的表达，表达蛋白占拟楠芥植株种子中可溶性蛋白的15％左右。本结果说明植物中抗体表达量与抗体本身的序列密切相关。
4用花椰菜嵌纹病毒35SRNA基因启动子P35S(此启动子为组成性启动子，理论上在植株的任何器官都能表达)构建了中和性人源抗甲肝病毒scFv-Fc融合抗体表达质粒P35SscFv-FcHA16+KDEL及P35SscFv-FcHA16-KDEL，并分别转化了生长中的拟楠芥植株及拟楠芥悬浮培养细胞(来源于拟楠芥植株的叶子)。对拟楠芥悬浮培养细胞中表达蛋白的分析表明，P35SscFv-FcHA16+KDEL质粒得到了很好的表达，表达蛋白占细胞中可溶性蛋白的1％以上；而P35SscFv-FcHA16-KDEL质粒表达的蛋白则大部分降解了。对拟楠芥悬浮培养细胞中表达的P35SscFv-FcHA16+KDEL融合抗体进行了纯化，ELISA以及体外中和实验表明表达的融合抗体仍保持了很好的生物学活性，与相应的CHO细胞中表达的CHOIgGHA16抗体相比，没有明显的区别。
转化的拟楠芥植株叶子中的上述两个质粒得到了在拟楠芥悬浮培养细胞中类似的表达结果。
5用双子叶植物种子储存蛋白特异性启动子Pfas和Parc51分别控制IgG抗体的重链和轻链基因，构建了在一个质粒中同时表达人源抗甲肝病毒IgG抗体轻重链基因的表达质粒PfasParc51IgGHA16+KDEL。同时，用花椰菜嵌纹病毒35SRNA基因启动子P35S分别控制IgG抗体的轻重链基因，在一个质粒中同时表达人源抗甲肝病毒IgG抗体轻重链基因的表达质粒P35SIgGHA16+KDEL，并分别转化了生长中的拟楠芥植株及拟楠芥悬浮培养细胞。拟楠芥转基因植物种子中表达蛋白的分析表明，在种子中的表达蛋白大部分降解了，而在拟楠芥转基因植株叶子中的抗体则得到了很好的表达。在悬浮培养细胞中的P35SIgGHA16+KDEL质粒同样得到了很好的表达，表达蛋白占细胞可溶性蛋白的1-2％。对悬浮培养细胞中表达并纯化后的P35SIgGHA16+KDEL抗体的ELISA以及体外中和实验表明，表达的抗体仍保持了很好的生物学活性，与相应的CHO细胞中表达的CHOIgGHA16抗体相比，没有明显的区别。
综上所述，植物中重组抗体的表达量不但与抗体本身的序列有关，还与所用的植物种类有关，与抗体在植物中的表达器官有关，以及表达抗体在细胞中的定位有关，也与启动子，5’及3’非编码区序列有关，需要具体情况具体对待。植物中表达的人源抗甲肝病毒抗体与相应的CHO细胞中表达的IgG抗体相比，结合甲肝病毒抗原及体外中和甲肝病毒的活性没有明显区别，证明了植物表达系统表达人源抗病毒抗体的可行性。但植物中表达抗体的糖基化形式与哺乳动物细胞有所不同，是值得进一步探讨研究的工作。