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山豆根为豆科植物越南槐Sophora tonkinensis Gagnep的干燥根和根茎，药性苦寒，具有清热、解毒、消肿、止痛的功效，归肺、胃经。临床常用于咽喉、口舌生疮等。近年来，关于山豆根的研究报告以及本课题组早期研究表明，山豆根能够引起肝脏毒性。然而其引起肝脏毒性的物质基础尚不明确，本课题将山豆根水提浸膏粉分为五个不同部位，通过小鼠、斑马鱼、大鼠的动物实验推断其致肝脏毒性的部位。 目前，预测和诊断药物性肝损伤的主要指标仍是与肝毒性相关的传统生物标志物。然而由于在灵敏度和特异性方面存在许多局限性，无法满足当前药物安全评价的要求。本课题采用大鼠肝脏毒性模型，通过基因组学、胆汁酸检测、血清生化分析技术筛选并找出对其肝毒性特异性好、灵敏度高、稳定的生物标志物。 1、山豆根各部位的分离制备 目的:将山豆根水提液分为五个不同成分的部位，并考察分离稳定性。方法:将质量可控的山豆根水提液浸膏粉用萃取分离的方法分离为多糖、有机酸、黄酮、生物碱类及其他物质五个部位，采用中药指纹图谱考察分离工艺的稳定性。结果:不同批次的各个分离部位的相似度均在95％以上。结论:分离制各工艺稳定可行，并制得后续试验所需供试品。 2、山豆根各部位对小鼠的毒性研究 目的:将分离所得部位对小鼠进行急性毒性研究及肝脏毒性研究，计算水提浸膏粉对小鼠的LD50并确定其致小鼠肝脏毒性的毒性物质所在部位。方法:取昆明种小鼠，随机分为40、32、25.6、20.5、16.4、13.1g/kg六个剂量组，每组10只动物，灌胃给药。统计各组死亡情况。用Bliss软件计算其LD50。根据急性毒性实验结果选择多次给药的给药剂量。将昆明小鼠共分为:空白对照组、山豆根水提浸膏粉全组分组、醇沉部位、乙醚部位、二氯甲烷部位、正丁醇部位、剩余水相。每组12只动物，雌雄各半。连续灌胃给药7天。采用全自动生化仪测定血液生化指标ALT、AST、ALP、TBA、TBiL的水平，并进行肝脏组织病理学检查。结果:山豆根水提浸膏粉对小鼠的LD50为23.79 g/kg。LD50的95％可信限为20.92～27.13g/kg。二氯甲烷部位组动物生化指标ALT出现显著性上升，肝脏组织出现肝细胞肿胀、炎症浸润。结论:各分离部位中二氯甲烷组出现了一定程度的肝脏毒性，毒性症状较相当给药剂量的全组分组略重，提示二氯甲烷部位可能是山豆根致小鼠肝脏毒性的主要物质部位之一。 3、山豆根各部位对斑马鱼的毒性研究 目的:将分离所得部位对斑马鱼进行急性毒性研究及肝脏毒性研究，计算水提浸膏粉对斑马鱼的LC50并确定其致斑马鱼肝脏毒性的毒性物质所在部位。方法:将一定阶段的斑马鱼处理到5dpf,进行药物的一般毒性评价，计算确定药物的半数致死浓度(LC50)、最大非致死浓度(MNLC)以及药物的未见毒性反应浓度(NOAEL)，鉴别药物的毒性靶器官。基于斑马鱼表型评价药物肝脏毒性，确定药物的LC10和最大非致死浓度(MNLC)后，评价斑马鱼的肝脏大小、肝脏变性、卵黄吸收并进行肝脏组织病理学分析。结果:醇沉部位、二氯甲烷部位以及剩余水相可能存在肝脏毒性，但其中二氯甲烷部位的LC50最小（为165μ g/mL），即毒性最大。二氯甲烷部位对斑马鱼的肝脏毒性实验结果显示，当给药浓度大于等于1/10MNLC时，会诱发斑马鱼的肝变性，斑马鱼会出现卵黄囊吸收延迟，并且呈现出浓度依赖性。结论:山豆根水提浸膏粉及二氯甲烷部位对斑马鱼有明显的肝脏毒性，且毒性作用有明显“量-效”关系。 4、山豆根二氯甲烷部位对大鼠的肝脏毒性及生物标志物研究 目的:研究山豆根水提浸膏粉及其二氯甲烷部位对大鼠的肝脏毒性，并通过炎症因子及microRNA筛选其致肝脏毒性的生物标志物。方法:取Wistar大鼠，分为空白对照组，低（3g/kg生药）、中(9g/kg生药)、高（30g/kg生药）以及全组分组(30g/kg)五个组别，每组12只，雌雄各半。连续给药28天，第29天用25％乌拉坦麻醉后，取血、解剖动物取材。采用全自动生化仪测定血液生化指标ALT、AST、ALP及TBA的水平。计算肝脏指数，取肝脏观察组织病理学变化。选用RT-PCR方法检测肝脏组织中炎症因子基因表达变化的情况;并用Bio-Plex悬液芯片测定与其肝脏毒性相关的细胞因子;microRNA芯片检测组织及血清中各microRNA表达变化情况，筛选差异基因;并通过ROC分析筛选肝脏毒性生物标志物。结果:山豆根二氯甲烷部位给药后，其高剂量组肝脏组织的脏脑比及脏器系数均有显著性上升(P＜0.01)，病理组织学观察结果显示高剂量组出现肝细胞肿大及炎症等，与空白组相比有显著性差异(P＜0.01)。高剂量组生化指标ALT、ALP、TBiL和GLDH均有显著性上升(P＜0.01)。以该肝脏毒性模型为基础，ROC曲线分析结果显示GLDH+IL-12β联合指标的诊断效能最高，其AUC为0.894，为最优诊断生物标志物。另外microRNA-185-5p在三个不同剂量的给药组中均与空白组相比有显著性变化，且与剂量有相关性，提示其也为潜在生物标志物。 结论:山豆根二氯甲烷部位为其肝脏毒性的主要物质基础之一，且其毒性效应具有明显的“量-效”关系。GLDH+ IL-12β作为联合诊断指标，可以作为诊断此肝脏毒性的生物标志物，ROC分析结果显示它们对肝脏毒性有良好的检验效能。microRNA-185-5p为潜在的肝脏毒性生物标志物。