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重组肺炎支原体P1蛋白基因片段克隆表达及其抗体的制备肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae，Mp)属于柔膜体纲、支原体目、支原体科、支原体属，在相差显微镜及扫描电镜下观察，肺炎支原体有高度多形性。肺炎支原体共分两型，一型是以M129为代表的Group1，另一型是以FH为代表的Grup2。Mp是引发人类原发性非典型肺炎及其它呼吸道感染性疾病如支气管炎、咽炎的常见、重要的病原之一。除呼吸道外，尚可引起其它系统严重的并发症。肺炎支原体没有细胞壁，对作用于细胞壁的抗生素不敏感。
对肺炎支原体感染的实验室诊断，主要是通过支原体分离培养、血清学检测和分子生物学等方法，而这些方法存在着各自不同的优缺点，因此国内对Mp的实验室诊断尚未走入正轨，甚至有些医院尚未建立对Mp感染的实验室诊断。
目的 本研究旨在得到肺炎支原体主要粘附蛋白-P1蛋白的具有抗原性的表达蛋白，并研制出针对临床常见病原肺炎支原体的特异性抗体，为临床Mp特异性抗原、抗体检测及相关研究做好准备。
方法 针对肺炎支原体P1蛋白，通过查阅国外文献和对P1蛋白结构基因进行分析，有针对性地选取在肺炎支原体Grup1与Group2中的基因同源性高、含有抗原决定簇的蛋白编码基因。设计含有克隆所需酶切位点的上、下游引物，以肺炎支原体标准株FH(ATCC15531)为模板扩增目的基因片段。对PCR产物进行回收、纯化，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切目的基因和原核基因表达载体pET-28C(+)后进行连接，构建高效表达重组质粒，质粒转化宿主菌BL21后，通过卡那抗性筛选出阳性克隆株。
阳性克隆株经IPTG诱导表达出可溶性蛋白，并通过Ni-Agarose亲和层析柱纯化。用酶联免疫吸附实验(ELISA)对纯化后重组P1蛋白进行Mp抗原性检测。
用纯化后重组P1蛋白免疫BALB/c小鼠，抗原蛋白分别用弗氏完全或不完全佐剂进行乳化，免疫方法采取腹腔注射，最后一次免疫后两周内摘眼球取血。通过ELISA试验检测免疫血清同Mp标准株的反应效价。以未免疫的正常小鼠血清作阴性对照。同时，用上述免疫血清与人类易感的生殖支原体、解脲支原体、人型支原体进行交叉反应检测。
以纯化的重组P1蛋白25μg/只免疫BALB/c小鼠，第一次免疫加等体积的福氏完全佐剂。20天后进行第二次免疫，加等体积的福氏不完全佐剂。28天后进行第三次免疫，加等体积的福氏不完全佐剂。7～10天后用ELISA检测免疫结果，阳性者进行连续三天腹腔注射不加佐剂的P1蛋白进行加强免疫。72～96h内进行细胞融合。
通过传统的杂交瘤技术制备抗支原体单克隆抗体，采用重组P1蛋白用ELISA法进行筛选。同时，我们用上述单抗与人类易感的生殖支原体、解脲支原体、人型支原体进行交叉反应检测。
结果 PCR扩增得到肺炎支原体P1蛋白近C端的一段DNA片段，定向克隆至原核表达载体pET-28C(+)上，成功地构建了重组表达质粒pET-28C(+)/P1。
表达肺炎支原体P1蛋白近C端重组蛋白：pET-28C(+)/P1/Mp，此蛋白为可溶性蛋白。所表达的重组蛋白与预计分子量相符(相对分子质量为20000)。蛋白的表达量为15mg/L。
检测P1蛋白抗原性的ELISA实验显示，P1蛋白与Mp抗血清有较好的反应性，蛋白敏感性大于1ng/ml。
在重组P1蛋白免疫小鼠获得的抗血清与Mp的反应中，检测到的抗体滴度可达到1∶1600。获得针对肺炎支原体重组P1蛋白的特异性单克隆抗体2株，在ELISA检测中均与P1抗原有较好的反应特异性，抗体滴度可达到1：800～1600(P1抗原：5μg/ml)。但是，2株单抗与Mp抗原的反应较弱，当抗原浓度达到20μg/ml时，抗体滴度为1：1000。
结论 本研究选取的基因片段成功构建了重组表达载体，表达的融合蛋白具有较好的免疫原性，其P1抗血清与肺炎支原体在ELISA检测中具较好的反应特异性和一定的效价。同时，本实验也证明P1蛋白近C端具有抗原性较强的抗原决定簇。本研究得到P1蛋白及其抗血清有望应用于今后临床肺炎支原体感染的抗原、抗体快速早期诊断中。本实验得到的单克隆抗体在ELISA检测中与P1蛋白有较强反应性，但与Mp全抗原反应较弱，有待进一步研究。