【摘 要】
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禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的一种禽类重要的肿瘤性疾病,目前在我国的流行和危害越
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禽网状内皮组织增生病(Reticuloendotheliosis,RE)是由网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)引起的一种禽类重要的肿瘤性疾病,目前在我国的流行和危害越来越严重。该病直接导致禽死亡虽然并不常见,但感染禽表现生长迟缓、免疫抑制,降低疫苗接种的免疫应答而导致免疫失败和降低鸡体对疾病的抵抗力,导致禽群的淘汰率和死亡率升高,进而给养禽业带来很大的经济损失。为了建立ELISA等快速、特异、简便的诊断技术,表达REV的囊膜糖蛋白env基因作为抗原并研制其相应的抗体是十分必要的,对该病的防控具有重要的现实意义。根据已发表的REV毒株鸭脾坏死病(SNV)的序列,设计并合成一对引物,以SNV前病毒cDNA全基因组克隆为模板,通过PCR技术,扩增出该病毒的囊膜糖蛋白env基因的整个开放阅读框(ORF);将PCR产物按正确的阅读框架定向克隆进pGEX-6P-1载体中谷光甘肽-S-转移酶(GST)的下游,将重组质粒转化进宿主菌BL21中,在1.0 mmol/L IPTG的诱导下,env基因以融合蛋白的形式获得了良好的表达,表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,证实其表达的融合蛋白的大小为72kD;Western-Blot和ELISA检测结果表明,纯化的pGEX-6P-1-env重组融合蛋白抗原与REV标准阳性血清呈现良好的反应性。将表达产物回收后免疫小鼠,所得的抗血清可与SNV感染的鸡胚成纤维细胞(CEF)在免疫荧光试验(FA)呈阳性反应。这表明,体外表达的重组融合蛋白具有很好的免疫原性,而且保留了天然蛋白所具有的抗原性。以纯化后的pGEX-6P-1-env重组融合蛋白为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA方法。经条件优化,抗原的最佳包被浓度为0.2μg/孔。以建立的方法及条件对8份鸡血清进行了初步的应用检测,结果表明反应具有很好的特异性和敏感性。本课题研究的结果表明,成功构建并原核表达的囊膜糖蛋白env基因的重组融合蛋白抗原以及建立的ELISA技术,为REV感染的诊断和疫苗免疫后抗体效价的监测提供了一种有用的工具。
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