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北极地区是地球上最重要的高寒生态系统之一。在当前全球变暖的大背景下,极地环境温度变化加剧、物种分布及生物化学循环均引起了广泛关注。微藻作为极地生态系统中最重要的初级生产者和食物网的基础,能否快速适应极区温度变化,决定了其种群能否在环境变化过程中占据优势生态位,进而影响极地生态系统群落的结构,乃至该地区海洋的碳汇能力。因此,极地微藻的环境温度适应机制一直是极地生物环境适应性的研究热点之一。此外,极地微藻是在极端环境中生存的一类极端微生物,由于其生存环境特殊,致使其天然产物具有特殊的结构和较强的生物活性,具有广阔的应用前景。本论文主要以中国极地研究中心保藏的一株分离自北极斯匹次卑尔根群岛黄河站(78°55’N;11°56’E)附近夏季冰川融水的小球藻(Chlorella sp.Lw2006/68)为实验材料。分别在中温(15℃)(对照)、低温(3℃)、高温(24℃)处理下,观察其相应的生理生化代谢规律,并结合转录组和蛋白组技术,在不同层面(生理代谢、基因表达、蛋白)上探讨Chlorella-Arc在高温/低温胁迫下的的响应机制,以此为极地微生物应对环境变暖的适应机制提供数据资料。另外,前期实验中发现Chlorella-Arc的活性物质—多糖,在Chlorella-Arc抗逆过程中发挥重要作用。尤其是在高温胁迫下,多糖合成的相关基因及蛋白均积极响应。极地微藻多糖作为极地微生物活性物质之一,具有巨大的应用潜力。基于此,对Chlorella-Arc多糖提取工艺、结构和抗氧化活性进行初步探索,希望为极地微生物活性物质的应用奠定基础。具体研究结果如下:1.Chlorella-Arc在3-24℃范围内均表现出良好的生长状态。低温时色素含量(叶绿素a、叶绿素b、类或萝卜素、)及各光合参数(Fv/Fm,Fv/Fo,ETR,qP,YⅡ)均较低,发生了光抑制。Chlorella-Arc通过调节补光色素蛋白复合体(LHC)的大小来减少光能的捕获,从而减缓光抑制的影响。高温时,Chlorella-Arc热耗散能力增强。另外,较中温对照及低温处理组,高温时Chlorella-Arc可获得较高的胞内可溶性糖(38.89±1.67 μg/mL)及总可溶性糖(74.6±8.45 μg/mL)含量。而低温胁迫时,脂肪(35.4%)及蛋白质(9.3mg/g)积累较多。在应对高温/低温胁迫过程中,Chlorella-Arc具有独特的保护策略。2.采用Illumina Hiseq 4000技分别对三个温度处理下的Chlorella-Arc进行转录组测序。共获得33658条非冗余Unigene。转录组测序数据经qRT-PCR验证可靠,原始数据已上传至NCBI的SRA数据库中。与中温对照相比,高温胁迫时上调/下调表达的基因分别为3447个/1164个,低温胁迫时上调/下调表达的基因分别为1351个/3109 个。3.Chlorella-Arc转录组差异表达基因分析结果表明,低温下PS Ⅱ和PS Ⅰ中PsbB(CP47),PsbC(CP43),PsbA(D1),PsaA 和 PsaB 均出现上调表达,认为 Chlorella-Arc主要通过提高光能从天线色素传递到反应中心的效率,从而维持较高的光化学活性。Chlorella-Arc通过下调表达LHC相关基因来减少光能捕获,与低温时减小LHC的大小事实相一致,从而有效的阻止了光抑制的发生。低温下叶黄素、玉米黄质和黄质合成过程所需关键酶基因lut5,lut1和zep基因表达上调,表明叶黄素循环参与了低温光保护机制。结合生化物质含量变化和转录组差异表达基因分析,我们推断Chlorella-Arc通过调节碳流分配途径来适应高/低温胁迫,且C4-like途径也在不同温度下碳分配调控中发挥重要作用。4.不同温度处理下Chlorella-Arc的差异蛋白组质学研究。结果表明:共鉴定到2018个蛋白质,高温和低温分别诱导了 938和760个蛋白显著表达。Chlorella-Arc转录组和蛋白组关联分析结果表明,3个比较组(HTvs CT,LT vs CT,LT vs HT)内关联的基因数量分别为103,144和219个。5.与转录调控不同的是,低温胁迫下PSⅠ及PSⅡ相关蛋白没有明显上调表达,且PSⅡ的核心蛋白亚基之一 CP47和光合碳固定关键酶Rubisco表达下调,Chlorella-Arc碳固定速率的降低是限制其生长的主要因素,这与生理结果相一致。另外,发现ATP合成酶(β、δ、b亚基)与TCA循环关键酶(柠檬酸合成酶CS、异柠檬酸脱氢酶IDH、琥珀酰-CoA合成酶SCLA)在高温/低温胁迫下均表达上调,提高ATP合成效率将为修复受损、一些生化成分的转运及藻细胞正常的生长提供充足的能量。6.与转录水平一致的是,高温胁迫下糖异生途径关键酶(丙酮酸羧激酶PEPCK、果糖-1,6-二磷酸酶FBP),淀粉合成途径关键酶(淀粉合成酶Starch S、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶UGP2、葡萄糖-1-磷酸腺苷酰转移酶GlgC)及核苷糖合成途径关键酶(UDP-葡萄糖4-差向异构酶GALE、磷酸甘露糖变位酶PMM、UDP-葡萄糖-6脱氢酶UDGH)均上调表达,说明高温时Chlorella-Arc碳流向糖类物质积累过程在转录水平就已开始。转录调控中,低温时细胞内碳流向脂类物质合成机制较为模糊。但在蛋白水平明确表现出低温时糖酵解途径、丙酮酸生成乙酰基CoA的过程增强,且ACCase上调表达,积极促进细胞内碳流通过糖酵解生成丙酮酸,然后以乙酰基CoA的形式,流向了脂肪酸合成,由此认为该调控主要发生在转录后。糖酵解/糖异生是指挥Chlorella-Arc细胞内碳流向糖类/脂肪输送的重要调控途径。另外还考察了 Chlorella-Arc核糖体(热不稳定延伸因子EF-Tu,信号识别颗粒SRP)及磷脂酰肌醇信号系统(钙调节蛋白CALM,肌醇-1-磷酸二酯酶IMPA)相关蛋白,低温下它们均上调表达,增强的蛋白质合成及自身复杂的信号传导有利于减轻下外界胁迫对细胞的伤害。高温/低温胁迫下,抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶CAT)和谷胱甘肽酶系统(谷胱甘肽还原酶GSR,谷胱甘肽过氧化物酶GPX和谷胱甘肽硫转移酶GST)的上调表达,说明这几种保护酶间的协同作用减轻了 Chlorella-Arc由于高温/低温胁迫导致的不良后果,从而维持细胞正常的代谢和生长。7.利用传统热水提取法提取Chlorella-Arc多糖。通过响应面优化实验确定了提取Chlorella-Arc多糖的最佳优化条件(水料比48:1,提取温度80℃,提取时间3 h),并获得实际最高多糖提取率9.61±0.11%。粗多糖通过DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephadex G-100纯化,可获得P-Ⅰ,P-Ⅱa,P-Ⅱb,P-Ⅲ等组分。发现当各多糖浓度为5mg/mL时,P-Ⅱa的抗氧化活性最强,表现为对DPPH自由基,羟基自由基,超氧自由基的清除效率分别达到60.20±1.20%,72.10±1.50%,42.20±1.60%。经纯度鉴定,P-Ⅱa中蛋白质及核酸成分较少,组分单一。对P-Ⅱa进一步结构分析。发现P-Ⅱa主要由鼠李糖,阿拉伯糖,葡萄糖和半乳糖组成,几者的摩尔比为3.67:1.08:0.66:0.38。硫酸根含量约为11.58%。由FT-IR和NMR共同证明P-Ⅱa是一种同时存在α-和β-构型的杂多糖。