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背景
免疫抑制剂在器官移植和自身免疫性疾病的临床治疗中起着举足轻重的作用。但是，免疫抑制剂的副作用，包括免疫抑制引起的感染、肿瘤发生率增加等，也一直困扰着临床医生。在器官移植中，诱导受者对异基因移植物的特异性免疫耐受，减少、甚至撤除免疫抑制剂，一直是免疫学家和临床医生的一个梦想。这也是理论上解决异基因移植排斥，移植物抗宿主病等临床问题的最佳方案。
在器官或组织移植中，稳定嵌合与特异性耐受诱导密切相关。已有报道，骨髓间充质干细胞与造血干细胞联合移植在受者体内可检测到稳定的造血系嵌合，并能诱导对供者的特异性耐受。但骨髓移植前预处理的毒性、移植失败的风险和移植后出现的急、慢性移植物抗宿主病等问题，使骨髓移植仍然局限于恶性肿瘤或严重免疫系统疾病的患者，不适合用于特异性免疫耐受的诱导。最近报道，在未作任何预处理的大鼠中，胚胎样干细胞移植后在其体内可建立造血嵌合，并能诱导对随后相同供者来源的心脏移植物的特异耐受。这一发现对寻找理想的免疫耐受诱导方法的研究者是一个很大的鼓舞。
最近，我们以及其他实验室都观察到骨髓源的间充质干细胞(mesenchymal stemcell，MSC)不仅具有多向分化潜能，使其成为分化和发育的重要研究材料；又因其低免疫原性和免疫调节活性，使其成为细胞移植治疗的重要目标细胞。Koc ON等(1999)、Devine SM等(2000)、Bartholomew A等(2002)、Bartholomew A等(2003)也相继报道了相近的实验结果。在小鼠和灵长类动物中，输注MSC可以延长异基因皮肤移植物的存活。在造血系统恶性肿瘤患者接受骨髓干细胞移植的同时输注供者来源的MSC，观察到MSC移植组的移植物抗宿主病(graft versushost disease，GVHD)发生率明显低于未移植MSC组。这些初步的结果都为MSC的免疫调节特性提供了直接的证据。
据统计20％的患者因为得不到合适的器官供体，不能进行器官移植而丧失生命。这种状况一直激励着科学家对非人源器官移植进行可能性研究，后来发现异种移植是解决器官移植中供体缺乏的有效手段之一。研究表明，猪在正常解剖、生理以及疾病的发生机理方面均与人很类似，猪的器官与人的器官大小相仿且发生人猪共患疾病的可能性很小，被认为是人类临床异种器官移植的首选供体。而近交系小型猪因具有基因纯合度高，遗传背景清楚等优点而成为异种器官移植研究领域中不可代替的实验模型，甚至可能是异种器官移植中组织和器官的最可靠提供者。近交系猪因具有相同的基因型，表现型也一致，在生长发育的一定阶段器官有一定的规格，可以根据不同的需要选择不同阶段的近交系实验动物进行异体器官移植，且实验结果正确、可靠。
目前，MSC对免疫系统影响及其机制还并不十分清楚，它们潜在的临床应用价值，包括诱导异基因移植物耐受和免疫调节作用，还有待于进一步的研究。
目的
本实验室前期已成功构建了永生化BMI。MSCs细胞株，同时发现BMI-MSCs具有低免疫原性和免疫调节作用，而猪MSC在人体内微环境中，将进一步发生分化。本课题主要目的是通过做细胞生长曲线和RT-PCR、单向混合淋巴细胞反应等方法研究家猪MSC的最佳培养方案及在体外诱导分化后是否还能维持其低免疫原性，仍具有免疫调节作用，进一步探讨猪MSC的临床应用可行性。
方法
原代培养MSC细胞从版纳微型猪近交系(Banna minipig inbred-line，BMI)骨髓中分离获得，永生化BMI-MSCs由本室刘瑾等构建。选择第3代原代培养BMI-MSCs细胞和第14代永生化BMI-MSCs两株细胞，接种于96孔板中，设置37℃、38℃、39℃、40℃四个不同的培养温度，每天MTT法测定OD值，测定7天。绘制细胞生长曲线从而判定最佳体外该细胞培养温度。选用胎牛血清、猪血清、新生牛血清三种不同的血清，做生长曲线，筛定最佳培养血清种类。再用β-甘油磷酸钠、地塞米松、抗坏血酸磷酸盐等体外诱导其分化为成骨细胞，茜素红法染色矿化结节鉴定成骨分化的成功。以BMI外周血淋巴细胞(peripheral bloodlymphocyte，PBLs)为阳性对照，用RT-PCR法和流式细胞术法、免疫荧光法检测分化MSC的主要组织相容性抗原(swine lymphocyte antigenclass Ⅰ，class Ⅱ，SLA Ⅰ，SLA Ⅱ)的表达情况，用单向混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)的方法检测分化MSC是否仍不能引起人外周血淋巴细胞(human peripheral blood lymphocyte，hPBL)的增殖反应，同时用植物凝集素(phytohaemaglutinin，PHA)刺激hPBL增殖，检测分化MSC对hPBL的增殖是否仍具有抑制作用。
结果
1)原代BMI-MSCs体外培养所用血清经实验证明，10％胎牛血清优于10％猪血清，更优于10％小牛血清。10％胎牛血清和10％猪血清均适宜原代BMI-MSCs的生长，而10％小牛血清不能满足原代BMI-MSCs的正常生长。
2)永生化BMI-MSCs体外培养所用血清经实验证明，10％胎牛血清优于10％猪血清，更优于10％小牛血清。三种血清均能满足永生化BMI-MSCs的正常生长。
3)原代和永生化BMI-MSCs不同温度条件下体外培养实验证明，37℃、38℃、39℃、40℃四个温度两种细胞均可正常生长，四者间差异无统计学意义。
4)RT-PCR法检测未分化和分化BMI-MSCs上SLA Ⅰ、Ⅱ表达情况表明，未分化和分化BMI-MSCs上均有SLA Ⅰ表达，未分化BMI-MSCs上无SLAⅡ表达，分化BMI-MSCs上有SLAⅡ表达。
5)免疫荧光法检测未分化和分化BMI-MSCs上SLA Ⅱ(SLA-DR)表达情况同样表明，未分化BMI-MSCs上无SLAⅡ表达，分化BMI-MSCs上有SLAⅡ表达。
6)流式细胞术法检测未分化和分化BMI-MSCs上SLAⅡ(SLA-DR)表达情况也表明，未分化BMI-MSCs上无SLA Ⅱ表达，分化BMI-MSCs上有SLAⅡ表达。
7)经丝裂霉素C处理的未分化和分化BMI-MSCs与hPBLs的单向MLR结果表明，未分化和分化BMI．MSCs均不能刺激hPBLs增殖，具有低免疫原性。
8)经丝裂霉素C处理的未分化和分化BMI-MSCs加入到经PHA刺激的hPBLs中的单向MLR结果表明，未分化和分化BMI-MSCs均能抑制PHA引起的hPBLs的增殖。
结论
体外培养BMI-MSCs时，胎牛血清优于猪血清，更优于小牛血清。小牛血清几乎不能使原代BMI-MSCs细胞增殖，胎牛血清和猪血清均适宜该细胞的生长，胎牛血清优于猪血清。三种血清均适宜永生化BMI-MSCs细胞的生长，猪血清比小牛血清好，胎牛血清比猪血清更好。但温度组不同的BMI-MSCs细胞，其生长速度无显著性差异，在37℃、38℃、39℃、40℃四个温度原代和永生化BMI-MSCs细胞均可正常生长。
RT-PCR和流式细胞术、免疫荧光结果显示未分化MSC只有SLA I表达；分化MSC既有SLAI，也有SLAⅡ的表达。但单向MLR结果显示分化猪MSC与未分化猪MSC一样都不引起hPBL增殖反应，且仍具有抑制hPBL增殖的作用。即分化和未分化猪MSC均不仅不引起人淋巴细胞增殖反应，具有低免疫原性：且具有抑制人淋巴细胞增殖反应的免疫调节作用。