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背景： 细胞周期是一种非常复杂和精细的调节过程，细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)参与每个环节的起始和进程。目前已被发现并命名的CDK激酶有CDK1(cdc2)、CDK2、CDK3、CDK4、CDK5、CDK6、CDK7和CDK8等。其中CDK2由Elledge等在20世纪90年代初鉴定并命名，是目前已发现的11个CDKs成员中研究极为深入的周期调控因子之一。CDK2的激活是DNA复制的前提,并为保证S期持续进行所必需。研究认为,正是CDK2和cyclin E结合后触发细胞越过G1/S转折期，之后cyclinE即迅速降解,CDK2则和cyclinA结合调控S期的进程。 CDK2被发现与多种疾病有关，多项研究显示在肿瘤细胞中发现CDK2表达异常增多。Mihara等认为从口腔黏膜上皮异常增生到鳞癌CDK2的表达有显著改变，并且CDK2的表达与淋巴结转移、肿瘤病理分级、侵袭方式及较短的存活期都有显著相关性。目前，通过抑制CDK2及其相关蛋白的活性阻止肿瘤细胞的增殖以达到控制甚至根治肿瘤的目的成为人们治疗肿瘤新方向。 鉴于CDK2在细胞周期和细胞凋亡过程中发挥的重要作用及其在疾病诊断中的潜在价值，国内现已有通过原核表达体系表达CDK2蛋白的相关报道，作者使用质粒pGEX-6p-1作为表达载体表达CDK2上某一特定序列蛋白并用于多抗制备，但此试验中由于表达细胞本身蛋白表达量较高以及纯化等问题使制备出的抗体有非特异蛋白出现。虽然CDK2在原核表达体系中已得到表达，但是由于质粒选择、表达条件优化等方面的限制使目的蛋白表达量较低而表达菌自身蛋白表达量较高，不利于目的蛋白的回收纯化。而通过毕赤酵母表达CDK2蛋白目前国内未见报道。国外主要关注CDK2在细胞中的功能作用以及活性调节机制等方面，而对该蛋白使用原核和酵母表达体系进行表达的相关研究未见报道。 目的： 构建CDK2原核表达体系和毕赤酵母表达体系，分别获得高效表达CDK2蛋白和具有一定生物活性的CDK2蛋白。 方法： 从人新鲜血液中分离白细胞，提取总RNA做逆转录，以逆转录产物为模板，设计一对引物扩增 CDK2基因编码区序列；构建重组质粒；将重组质粒转入相应的表达菌株进行诱导表达；对诱导产物分别做SDS-PAGE和Western-Blot检测。主要步骤如下： 1.人总RNA的提取及逆转录 抽健康人静脉血通过Trizol法提取总RNA,使用逆转录试剂盒对提取总RNA进行逆转录获得cDNA，于-20℃保存备用。 2.PCR扩增目的片段 按照 GenBank发表的人 CDK2基因片段编码区的参考序列，以及载体 pET32a和pPICZαA的多克隆酶切位点，参考软件PrimerPremier5.0设计一对引物:P1:5’-CCGG’AATTCATGGAGAACTTCCAAAAGGTGGA-3’含Eco RⅠ酶切位点；P2:5’-ATAGC’GGCCGCGAGTCGAAGATGGGGTAC-3’含NotⅠ酶切位点。为方便检测，针对扩增区域设计另外一对引物：P3:5-ACTGGCATTCCTCTTCCC-3；P4:5-TGGCTTGTAATCAGGCATA-3。由invitrogen广州分公司合成。以cDNA为模板扩增基因片段。 3.重组质粒的构建与鉴定 胶回收PCR产物，并分别与载体用Eco RⅠ和NotⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳，回收酶切产物后以T4DNA连接酶4℃连接过夜，将过夜连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在含相应抗生素的低盐LB平板上筛选阳性克隆，做菌落PCR鉴定及DNA测序。 4.重组质粒转化表达菌 对鉴定正确的菌落大量克隆后提取重组质粒，将重组质粒分别转入相应的感受态细胞，于含抗生素的低盐LB平板上筛选阳性克隆，做菌落PCR鉴定及DNA测序。 5.重组蛋白的诱导 挑取筛选出的阳性BL21（DE3）单克隆菌株接种于新鲜含氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养。取500ul过夜培养菌液于含10ml无抗生素新鲜LB培养基的烧瓶中，置于摇床内以37℃、240rpm/min剧烈摇动2小时后加入IPTG诱导培养0、1、2、3、4小时。 将鉴定好的表达菌挑取少量，接种于BMGY中培养增菌，待A600达到2-6（约16-18小时），换入1/5体积的BMMY液体培养基中，以0.5%的甲醇终浓度诱导表达0、24、48、72、96小时。 6.重组蛋白的SDS-PAGE鉴定以及重组蛋白的免疫学活性检测 对两种表达菌诱导的不同时间点收取的表达产物进行 SDS-PAGE和Western-Blot分析。 结果： 构建了pET32a-CDK2、pPICZαA-CDK2重组质粒；大肠杆菌BL21中SDS-PAGE显示在protein ladder55KD稍下方位置有深染条带（目的蛋白分子量约为52KD，其中包括CDK2蛋白自身分子量约34KD和质粒自身表达的标签蛋白约18KD）,Western-Blot显示在protein ladder55KD标准量稍下方有荧光条带；毕赤酵母GS115中SDS-PAGE显示在protein ladder35KD稍下方有深染条带（目的蛋白分子量约为34KD），Western-Blot显示在protein ladder35KD标准量稍下方有荧光条带。 结论： 成功构建CDK2的原核表达体系和真核表达体系。通过SDS-PAGE对表达产物进行鉴定发现表达产物中含有与目的蛋白分子量大小相符的蛋白，可初步判断成功表达目的蛋白；通过使用CDK2单抗对表达产物进行Western-Blot分析可判定目的蛋白成功得到表达，并且可初步判断所表达的目的蛋白具有一定的免疫反应性。所表达的CDK2蛋白可为进一步研究提供基础和依据。