棉纤维细胞ATP合酶δ亚基及核苷糖合成关键酶基因的克隆与功能研究

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ATP是所有生物体进行生命活动的能量基础。在几乎所有生物中,线粒体ATP合酶δ亚基作为连接F0复合体和F1复合体的连接部分。本论文中我们通过生物芯片及定量RT—PCR分析发现,在棉花细胞伸长过程中,ATP合酶的δ1亚基而不是其它如α,β,ε等亚基,显著高调。与之相似,伸长纤维细胞的ATP/ADP比值显著高于胚珠或其他组织。GhATPδ1包含一个603bp的读码框,编码一个200氨基酸的蛋白质。这个基因在氨基酸水平上与酿酒酵母ATP16及拟南芥ATP4分别表现出37%和70%的一致性。GhATPδ1可以回复atp16△酵母突变体致死的表型,回复酵母与野生型酵母ATP/ADP比值相似,证明这个基因能在酵母中发挥相同的功能。从野生型开花后十天的纤维中纯化的线粒体比野生型或突变体胚珠的线粒体表现出更高的ATP合酶的活性。当向体系加入大肠杆菌表达的GhATPδ1蛋白后,野生型纤维或者突变体胚珠中的ATP合酶活性都有显著提高。外源施加ATP合酶的抑制剂寡霉素后,体外培养的胚珠表面的纤维生长受到了明显抑制,并且其ATP/ADP比值也显著降低。进一步在三种具有不同终长度的棉花种质中分析GhATPδ1的转录水平,发现终长度较大的种质资源中δ1基因的绝对表达量和持续表达时间都显著高于终长度较短的种质资源,暗示纤维细胞初生壁形成和延伸过程中需要大量的能量。因此,我们推测GhATPδ1对于线粒体ATP合酶的活性有重要影响,可能与棉花细胞伸长相关。   我们实验室前期的蛋白质组学分析获得与细胞壁多糖合成相关的7个在野生棉纤维发育时期显著高调的蛋白点。气相色谱分析细胞壁非纤维素多糖成分发现,与胚珠组织相比,快速伸长的纤维初生细胞壁含有显著多的阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖醛酸,而木糖和葡萄糖较少。实时定量PCR结果显示合成果胶多糖前体UDP—阿拉伯糖、UDP—鼠李糖和UDP—半乳糖醛酸的关键基因UER、GAE、UXE显著高调。在胚珠体外培养的培养液中添加果胶多糖的前体能显著促进纤维的伸长,而加入UDP—木糖等对纤维伸长没有影响。进一步的研究发现,乙烯信号促进果胶多糖合成关键酶的表达,暗示乙烯可以通过刺激果胶的合成来促进纤维的伸长。本论文表明,棉纤维伸长可能是一个高耗能过程,而受乙烯信号的调控的果胶多糖的生物合成可能是纤维细胞初生壁合成和纤维伸长的限速步骤。
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