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茄子青枯病是由茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的细菌性土传病害,是茄子的主要病害之一,威胁着我国茄子的生产。由于常规防治方法存在种种弊端,根际细菌介导的生物防治正成为备受人们关注的一种有效方法。本试验对茄子青枯病高效拮抗菌进行了筛选、鉴定,通过PCR的方法对其含有的抗生素合成基因进行了检测,对产拮抗物质的条件、拮抗物质的理化性质进行了初步研究,并利用高效液相色谱和液质联用对拮抗物质进行鉴定。研究结果分述如下:
(1)本试验共分离出40株形态不同的菌株,通过初筛、复筛得到具有明显拮抗效果的6株菌,其中菌株S20的抑菌效果最好。通过盆栽试验表明拮抗菌S20对茄子青枯病的防治效果达到了68.6％。
(2)通过形态观察、生理生化试验、16S rRNA基因同源性序列分析以及部分特异性基因序列分析,将菌株S20鉴定为解淀粉芽孢杆菌。
(3)通过PCR方法发现解淀粉芽孢杆菌S20基因组中含有sfp、fenB、bamA和ituA基因,它们分别是Surfactin、Fengycin、Bacillomycin和Iturin的生物合成相关基因。
(4)解淀粉芽孢杆菌S20在NA培养基中产拮抗物质的最佳条件为:培养时间84h、培养温度30℃、转速为170 r/min、初始pH7、装液量为60 mL/250 mL。
(5)从解淀粉芽孢杆菌S20的发酵液中提取的粗提物具有显著抑制茄科劳尔氏菌的效果,并且具有良好的热稳定性,能耐受100℃高温；粗提物在pH2.0～9.0范围内保持拮抗活性的稳定,而对强碱敏感；拮抗物质对蛋白酶K和胃蛋白的作用表现出高的稳定性,而胰蛋白酶能够在一定条件下将拮抗物质降解；拮抗物质对紫外线稳定。
(6)菌株S20发酵液经过酸沉淀、甲醇浸提等步骤得到脂肽类化合物的粗提物。经过高效液相色谱(HPLC)分离,发现了保留时间与Surfactin和Iturin A标准品的保留时间基本一致的峰,初步确定粗提物中含有Surfactin和Iturin A。按时间收集不同组分后检测各组分的拮抗活性,结果表明2-4 min的组分有拮抗效果,而在此组分中含有保留时间与Iturin A基本一致的峰,所以推测Iturin A是主要的拮抗物质。
(7)粗提液经HPLC-MS测定,证明分别含有Iturin、Fengycin和Surfactin三组抗菌活性物质。经ESI—MS/MS-CID技术分析,鉴定出第一组物质为C13-C16的Iturin A；第二组物质为C14-C19的Fengycin A和C14-C17的Fengycin B；第三组物质为C13-C15的Surfactin。