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研究背景近年关于H／RS细胞的起源、形态发生、及其生长和调节的分子机制研究有了很大的进展，研究表明H／RS细胞的起源绝大部分来自“残疾B淋巴细胞”。潜伏膜蛋白-1(LMP-1)的表达、CD99表达缺失和核因子κB(NF-κB)的持续活化是H／RS细胞形成的三大要素。最引人注目的是新近发现H／RS细胞的发生与mic2／CD99基因表达缺失有关。国外研究报道将反义mic2／CD99基因转染人B淋巴细胞瘤株BJAB和IM9细胞使CD99表达缺失，能显示出像HL一样的H／RS细胞的典型特征，出现H／RS样“镜影细胞”，高表达CD30和CD15；当再将mic2／CD99基因转入上述H／RS样细胞中，又可使出现的H／RS样细胞的形态特征消失，该细胞又恢复到B淋巴细胞瘤原有的表型特征，提示H／RS细胞的发生及免疫表型的变化与mic2／CD99基因表达缺失有关。研究表明，抑制细胞中CD99的表达，可以诱导具有HL组织学特征的H／RS细胞的产生。人CD99是一种分子量为32kDa的细胞表面跨膜糖蛋白，编码基因mic2位于X和Y染色体短臂假染色体区(PAR)的Xp22.32-pter和Yp11-pter上，连锁分析提示PAR是HL的潜在致瘤基因，参与血细胞的分化等。本课题组前期研究将小鼠B淋巴瘤细胞株mCD99L2基因沉默，下调CD99的表达，可以诱导H／RS样细胞的产生，并从免疫表型、生物学特性等方面验证其H／RS细胞部分特性。如果上调人HL细胞株中CD99表达，能否使其H／RS细胞特性消失或改变，回复到B淋巴瘤样细胞状态呢?鉴于此，本研究在验证了人HL细胞株L428细胞mic2／CD99基因表达缺失的基础上，利用分子克隆技术构建了pcDNA3.1(+)-CD99真核表达载体，经过稳定转染和克隆筛选，获得L428细胞mic2／CD99基因表达的L428-CD99克隆株，连续观察该株细胞中H／RS细胞的形态及表型改变，构建L428-CD99细胞模型，为进一步研究HL中H／RS细胞的起源及形成的分子机理奠定了的一定的实验基础。目的1．明确mic2／CD99在人HL细胞株和cHL组织中H／RS细胞的表达情况。2．构建mic2／CD99基因的真核表达载体。3．构建L428-CD99细胞模型并进行初步鉴定。方法1．设计寡核苷酸探针，采用分子原位杂交和免疫组化技术检测mic2／CD99在HL细胞株L428中及人15例cHL组织中H／RS细胞的表达。2．设计mic2／CD99基因特异性PCR引物，采用RT-PCR法从T淋巴瘤细胞株Jurkat细胞总RNA中获取mic2／CD99基因全长cDNA，克隆入T载体，筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定；设计含酶切位点的PCR引物，PCR获取mic2／CD99基因表达编码区，用限制性内切酶KpnⅠ和ApaⅠ双酶切取所需目的片段，利用分子克隆技术与pcDNA3.1(+)质粒重组，对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定，并经过测序证实。3．经过稳定转染和G418克隆筛选，上调L428细胞mic2／CD99基因，用软琼脂克隆形成法和96孔板有限稀释法筛选L428-CD99单克隆，并扩增培养该克隆，建立细胞模型，命名为L428-CD99。4．应用分子生物学技术检测L428-CD99细胞基因组与pcDNA3.1(+)-CD99载体整合情况；光镜下观察L428-CD99细胞形态特征；光镜下测试网格计数法动态监测由L428的H／RS细胞(直径=25um)转化为L428-CD99细胞的转化率；免疫组化检测CD99、CD30在L428-CD99和L428细胞中的表达；流式细胞术检测L428-CD99、L428细胞及人B淋巴瘤细胞株BJAB中CD30和CD15的表达。结果1．人HL细胞株和cHL组织中H／RS细胞mic2／CD99基因检测人HL细胞株和cHL组织H／RS细胞的mic2／CD99基因mRNA及蛋白(14／15，93.3％)呈阴性表达。2．mic2／CD99真核表达载体构建RT-PCR法获得mic2／CD99基因全长cDNA序列，DNA测序的结果与GenBank提供的已知序列(NM-002414)完全一致；重组质粒pcDNA3.1(+)-CD99中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mic2／CD99基因相应序列比较100％同源。成功构建了pcDNA3.1(+)-CD99真核表达载体。3．L428-CD99细胞模型的建立及初步鉴定利用脂质体转染L428细胞，经G418克隆筛选10d后停药，复苏培养10d后形成L428-CD99单克隆，扩增培养该克隆6-7d，出现明显形念改变，细胞体积变小，细胞核变小，本研究将转型的细胞命名为L428-CD99细胞。定期收获实验组(L428-CD99)和对照组(L428)细胞，检测转染质粒与细胞基因组整合情况，电泳可见基因片段558bp，证实载体已转入细胞，并整合到基因组。细胞计数结果显示，接种96孔板48h后，对照组(L428)中的大细胞或H／RS样细胞(直径=25μm)比例为(10.17±0.0194)％，实验组(L428-CD99)细胞中H／RS样细胞的比例为(3.33±0.0103)％，接种96孔板96h后，L428细胞中的大细胞比例为(11.50±0.0339)％，L428-CD99细胞中H／RS样细胞比例为(3.67±0.0126)％。绘制两组细胞中H／RS细胞生长曲线，经统计分析，L428-CD99细胞中H／RS样细胞与对照组细胞L428相比有统计学差异(P＜0.01)，大H／RS样细胞在L428细胞明显高于L428-CD99细胞。细胞片免疫组化实验显示，CD30蛋白在L428的H／RS细胞胞膜中呈阳性表达，而在L428-CD99细胞的H／RS细胞中呈阴性表达；流式细胞仪检测L428-CD99、L428、BJAB细胞株CD30和CD15的表达，阳性表达率分别为3.17％、55.24％、4.64％；检测CD15的表达，阳性表达率分别为4.15％、12.01％、3.44％。结论1．人HL细胞株L428和cHL组织H／RS细胞中mic2／CD99在mRNA水平和蛋白水平均为低表达，CD99低表达或表达缺失或可作为H／RS细胞表型的一个特点。2．上调人HL细胞株L428细胞mic2／CD99表达，可以诱导H／RS细胞形态、免疫表型和生物学特性发生改变或消失。创新之处1．证实人HL细胞株L428和cHL组织中H／RS细胞mic2／CD99的mRNA和蛋白呈低表达，提出CD99低表达或表达缺失或可作为H／RS细胞表型的一个特点。2．构建了L428-CD99细胞模型，发现mic2／CD99可诱导人HL细胞株L428中H／RS细胞发生转型。