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第一部分、胚胎干细胞培养及微囊化反应条件的优化
目的：建立胚胎干细胞微囊化培养体系，并进行反应条件的优化。
方法：分离胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层培养。胚胎干细胞经消化、纯化后与海藻酸钠混合，通过微囊发生器VAR J1，滴入CaCL2溶液中制备微囊。通过比较不同的海藻酸钠浓度、气流速度和反应温度对微囊制备的影响，进行反应条件的优化。通过倒置显微镜随机选取10个视野，计算形态规则、大小一致的微囊占所有微囊的比例测定微囊均一性。通过测微尺测定微囊直径。通过台盼蓝拒染试验检测反应温度对微囊化胚胎干细胞活性影响。
结果：饲养层细胞以3～5代胚胎成纤维细胞为最佳，胎龄以13.5d小鼠胚胎分离的胚胎成纤维细胞纯度最高，丝裂霉素C的处理时间以2.5h最佳。CCE胚胎干细胞在饲养层细胞上及添加白血病抑制因子的培养基中，呈克隆样生长，边缘清楚，表面平滑，结构致密。通过微囊发生器VAR J1，制作形态规则、大小一致的微囊。微囊直径随气流速度增大而减小，但气流速度超过4.5L/min后，微囊碎片明显较多，故4.5L/min为最佳气流速度，微囊直径为500μ m～600μm。微囊均一性随海藻酸钠浓度增高而提高，但2％与2.5％、3％海藻酸钠浓度微囊均一性差别无显著意义(p>0.05)，且2.5％、3％海藻酸钠粘度高，通过微囊发生器困难，故2％海藻酸钠为最佳浓度。微囊内胚胎干细胞在反应温度为4℃时的细胞活率明显高于37℃时细胞活率(p<0.05)。
结论：通过添加白血病抑制因子，CCE胚胎干细胞在饲养层细胞上呈克隆样生长，边缘清楚，表面平滑，结构致密。胚胎干细胞通过微囊发生器VAR J1，包被于微囊中，最佳反应条件为气流速度4.5 L/min，海藻酸钠浓度2％，温度4℃。
第二部分、微囊化培养对胚胎干细胞增殖分化的影响
目的：观察微囊化培养对胚胎干细胞增殖分化的影响。
方法：选用CCE小鼠胚胎干细胞，通过微囊发生器，包入微囊。通过添加白血病抑制因子，维持微囊内胚胎干细胞未分化状态。在6天培养中，倒置显微镜观察微囊内胚胎干细胞的形态学变化，同时检测了微囊内胚胎干细胞的未分化状态和及微囊内胚胎干细胞释放后形成拟胚体的能力。以微囊化胚胎干细胞不添加白血病抑制因子和胚胎干细胞无饲养层贴壁培养作为对照。
结果：添加LIF组胚胎干细胞在微囊内保持较高的细胞活性，并保持快速增殖能力。通过6天的培养，微囊内胚胎干细胞数量上扩增约8倍。碱性磷酸酶检测提示微囊内胚胎干细胞呈强阳性，RT-PCR检测提示微囊内胚胎干细胞强表达OCT4和Nanog基因。微囊内胚胎干细胞释放后，通过悬浮培养，具有很好的形成拟胚体能力，并具有向三个胚层分化的能力。微囊化胚胎干细胞不添加白血病抑制组和胚胎干细胞无饲养层贴壁培养组细胞增殖缓慢，培养至第6天OCT4和Nanog基因表达明显减弱。
结论：胚胎干细胞通过微囊化培养，同时添加白血病抑制因子，能够快速增殖和保持未分化状态，可作为胚胎干细胞一种规模化扩增方法；除去白血病抑制因子后，胚胎干细胞无论是无饲养层贴壁培养还是微囊化培养都容易分化。
第三部分、微囊化胚胎干细胞定向诱导分化为肝细胞
目的：胚胎干细胞由于具有无限增殖、自我更新和多种分化的潜能，来源于胚胎干细胞的肝细胞被公认为是最有前途的细胞之一，但到目前为止，可控制的规模化胚胎干细胞分化平台研究仍很少。细胞微囊化为细胞大规模、高活性体外培养提供了新的技术支持。本研究中，我们通过应用细胞因子，诱导微囊化胚胎干细胞体外分化为肝细胞。
方法：选用CCE小鼠胚胎干细胞，通过悬浮培养5天形成拟胚体。拟胚体消化为单个细胞，通过微囊发生器，包入微囊。拟胚体细胞包入微囊为0天。为进一步诱导分化，根据小鼠肝脏发育机制，0～7天加入aFGF，7～14天加入HGF，10～14天加入OSM、DEX和ITS。细胞分化过程中通过倒置显微镜观察形态学变化。RT-PCR检测肝细胞基因表达。免疫荧光检测ALB、CK18的表达。ELISA法和尿素合成试验检测肝细胞的合成和代谢功能。
结果：我们发现胚胎干细胞来源的拟胚体细胞在微囊内保持较高的细胞活性。通过细胞因子定向诱导，微囊内细胞表达肝细胞基因如AFP，ALB，Cyp7al，CK18，TTR和TAT，分泌ALB和尿素，在第14天免疫荧光试验能检测到ALB和CK18的表达。但是在自发分化组，微囊内胚胎干细胞不能分化为肝细胞。
结论：微囊化胚胎干细胞可以通过体外定向诱导分化为有功能的肝细胞。本研究有希望为胚胎干细胞在生物人工肝和肝细胞移植中的应用建立一个规模化分化平台。