多发性骨髓瘤细胞分泌的微泡与血管新生及疾病进展相关性的研究

• 作 者: 郭慧梅
• 出 处: 河北医科大学
• 发表日期: 2019年01期
• 关键词: 多发性骨髓瘤 微泡 血管新生 硼替佐米 来那度胺

多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是一种发生在浆细胞的恶性肿瘤,目前我国MM发病率为1-2/10万,在血液系统恶性肿瘤中发病率位居第二,且有逐年增加趋势。MM患者总体上5年存活率大约45%（高危患者不到2年）,中位生存3-4年。目前已知的MM的治疗方案还都不能治愈本病。因此,急需更加深刻地探索MM的发病机制,以期能找到更有效、更好的治疗方案。肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）对肿瘤进展的重要性近年来已被广泛认可。肿瘤在动态的和复杂的微环境中逐步形成,并得以持续的生长、侵袭和转移。癌细胞与微环境的相互作用可以调节癌细胞的侵袭和转移以及血管生成。肿瘤血管是TME的重要的组成部分。肿瘤具有诱导血管生成的能力,血管新生对肿瘤的发展至关重要,其生长、迁移和侵袭都依赖于血管新生。胞外囊泡（extracellular vesicle,EVs）,包括外泌体（exosome）、微泡（microvesicles,MVs）和凋亡小体（apoptosis body）,是各种细胞在激活或凋亡时脱落形成。近年的研究发现,EVs具有一系列的生理和病理作用。它们可促进血栓的形成,调节促炎过程,将RNA和蛋白质转移到细胞,引起细胞信号转导,调节细胞的功能。肿瘤EVs参与肿瘤发展和调节肿瘤细胞增殖;可调节免疫应答,影响致癌信号通路,促进肿瘤转移;含有细胞因子和生长因子,支持肿瘤微环境中的新血管的形成。EVs传递至靶细胞的信息决定于EVs的组分,而这又取决于EVs的起源细胞和EVs生成时的周围微环境。不同类型细胞来源的EVs都能够将复杂的信息传递给内皮细胞并诱发促进或抑制血管新生的信号。由于微环境的动态变化,EVs不断改变它们携带的货物的成分以调整血管形成过程。MM的发生、发展强烈依赖于骨髓（bone marrow,BM）微环境。MM细胞和骨髓微环境间持续的相互作用对肿瘤的发病、活力、增殖和耐药都是重要的。在过去的几年里,MM与BM微环境的相互作用完全归因于包括IL-6（interleukin 6）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、bFGF（basic fibroblast growth factor,碱性成纤维细胞生长因子）和其他因子在内的生长因子和细胞因子,但这些还不足以完全解释整个过程。直到最近,MM来源的EVs才被识别其作为MM和BM微环境之间交流的介质和肿瘤进展的促进剂。硼替佐米（bortezomib,BTZ）和来那度胺（lenalidomide,Lena）是目前治疗MM的主要药物,但仍有部分MM患者会出现耐药、病情进展等情况。单独靶向恶性MM细胞不足以根除疾病。MM是非常复杂的,且极其依赖于BM微环境得以生存和发展。因此,除了针对MM细胞自身的治疗之外,预期BM微环境中的细胞从支持肿瘤到杀伤肿瘤的变换有望成为更有效的治疗。目前,在关于MM血管新生机制的研究中,EVs与血管新生的关系的研究少见,硼替佐米、来那度胺对EVs血管新生影响的研究很罕见。本文通过研究MM中MVs和血管新生的关系,以及硼替佐米、来那度胺对MM MVs血管新生作用的影响及其作用机制,进一步探讨MM血管新生的相关机制,为MM的治疗选择提供新的理论基础。并通过鉴定、量化不同时期MM患者与正常对照的循环MVs,探讨MM患者恶性浆细胞来源的MVs以及与其他表型MVs和血管新生因子之间的相关性,从而研究其与疾病的血管新生、疾病进展的临床相关性,以探讨循环MVs作为新的诊断、监测病情的潜在用途。本研究分为以下三部分:第一部分多发性骨髓瘤细胞分泌的微泡对血管新生的影响目的:通过提取多个骨髓瘤细胞系的MVs并鉴定其大小、形态、免疫表型,观察MM MVs与内皮细胞间的作用方式,并研究其对内皮细胞增殖、迁移、侵袭、小管形成的影响,从而探索MM MVs对内皮细胞血管新生的影响。方法:1.培养RPMI8226、U266、KM3三种骨髓瘤细胞和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）。2.提取三种骨髓瘤细胞培养液上清的MVs,透射电镜观察MM MVs大小和形态,流式细胞术检测MM MVs大小和完整性、表型并计数,BCA蛋白定量方法对M MVs进行定量分析。3.MM MVs与HUVECs共培养后,共聚焦显微镜观察和流式细胞术检测MM MVs被HUVECs摄取的情况。4.通过CCK8方法检测MM MVs对HUVECs增殖的影响,应用划痕实验、Transwell小室侵袭实验、小管形成实验检测MM MVs对HUVECs血管新生的影响。结果:1透射电镜下MM MVs的形态观察差异离心法提取骨髓瘤细胞上清的MVs,透射电镜下观察骨髓瘤细胞来源的MVs形态,可见MM MVs为直径<1.0um的完整囊泡。2 MM MVs的大小、完整性、数量及表型的检测2.1流式细胞术发现MM MVs分布于1.1um标准微球的左下方,直径<1.0um。2.2流式细胞术分析样品的Calcein阳性率,即为具有完整膜的MVs所占百分比。所提取的三种骨髓瘤细胞的MVs的膜完整率如下:RPMI8226为89.90±1.39%、U266为86.77±3.95%、KM3为90.00±4.33%。2.3三种细胞MVs的产生率将处于对数生长期的三种骨髓瘤细胞分别以5×10⁵/ml的密度接种于培养瓶,培养24小时后检测。2.3.1 BCA蛋白定量方法测定MVs蛋白,结果:每5×10⁵个细胞所产生的MVs,RPMI8226为2.62±0.74 ug、U266为1.99±0.59 ug、KM3为2.70±0.65ug。KM3>RPMI8226>U266。2.3.2流式细胞术计数:每5×10⁵个细胞所产生的MVs,RPMI8226为（2.11±0.54）×10⁶个、U266为（1.60±0.51）×10⁶个、KM3为（2.17±0.62）×10⁶个。KM3>RPMI8226>U266。2.4流式细胞术检测发现,MVs表达起源细胞的标志,三种骨髓瘤细胞的MVs的CD138阳性率:RPMI8226为24.17±3.70%、U266为23.43±4.71%、KM3为20.53±2.59%。3 MVs被HUVECs摄取MVs与HUVECs共培养2h、6h、12h、24h后,通过共聚焦显微镜观察到MM MVs被HUVECs动态摄取。随共培养时间延长,摄取逐渐增多。另外,共培养24h后,HUVECs的CD138表达率从0.80%增加到9.23%。4 MM MVs促进HUVECs增殖不同浓度MVs（1ug/ml、5ug/ml和10ug/ml）与HUVECs共培养24h后,三种细胞的MM MVs均可促进HUVECs增殖,以10ug/ml最显著。5 MM MVs促进HUVECs血管新生5.1 MM MVs促进HUVECs迁移三种MM细胞株产生的MVs（10ug/ml）与HUVEC细胞共培养,在划痕0h和24h时分别观察、拍照,之后用Image软件计算愈合率。结果发现,三种MM细胞株产生的MVs均可增加划痕愈合率,促进HUVECs迁移,均有统计学意义。5.2 MM MVs促进HUVECs侵袭三种MM细胞株产生的MVs（50ug/ml）与HUVEC细胞共培养6h后,结果发现三种骨髓瘤细胞来源的MVs均不同程度地促进HUVECs的侵袭,与PBS组相比,RPMI8226MV组和U266MV组有统计学差异（分别为P<0.05和P<0.01）,虽然KM3MV组侵袭力也有升高趋势,但未达统计学意义（P>0.05）。5.3 MM MVs促进HUVECs小管形成三种MM细胞株产生的MVs（10ug/ml）与HUVEC细胞共培养6h后,于显微镜下观察、照相并计数闭合小管数。结果发现6h时三种骨髓瘤细胞来源的MVs均不同程度地促进HUVECs的小管形成,与PBS组相比,RPMI8226MV组和KM3MV组有统计学差异（分别为P<0.05和P<0.01）,虽然U266MV组小管形成也有升高趋势,但未达统计学意义（P>0.05）。小结:1.通过差异离心法能提取到完整的MVs,直径小于1.0um。MVs携带起源细胞的标志。2.MVs与HUVECs共培养,MVs能被HUVECs摄取。MM MVs可促进HUVECs增殖及血管新生。第二部分硼替佐米和来那度胺对体外骨髓瘤细胞分泌的微泡促血管新生作用的影响目的:血管新生在多发性骨髓瘤（MM）发病机制中起重要作用。微泡（Microvesicles,MVs）是一种细胞外囊泡,是细胞与细胞间通讯的重要参与者,第一部分研究已经证实正常培养的骨髓瘤细胞分泌的MVs可促进血管新生。硼替佐米和来那度胺是治疗MM的重要药物。因此,本研究的目的是研究硼替佐米和来那度胺对人骨髓瘤细胞分泌的MVs促血管新生作用的影响及其作用机制。方法:1.细胞培养RPMI8226人骨髓瘤细胞和人脐静脉内皮细胞（HUV ECs）。2.分组及处理条件对数生长期的RPMI8226细胞以5×10⁵/ml的密度接种,并随机分成5组。分别于细胞液中加入PBS（对照组）、10nM的硼替佐米、100nM的硼替佐米、1uM的来那度胺、10uM的来那度胺。培养24h后,差异离心法提取液上清的MVs,分别命名为N-MV、B10-MV、B100-MV、L1-MV和L10-MV。3.用流式细胞术计数各组MVs个数,BCA蛋白定量方法定量MVs,统计比较各组MVs的量。4.CCK8检测HUVECs增殖能力HUVECs以5×10⁴/ml密度种细胞于96孔板,分6组,分别加入PBS和以上5组的MVs（10ug/ml）（N-MV、B10-MV、B100-MV、L1-MV和L10-MV）,共培养24h后,CCK8检测细胞活力。5.HUVECs血管新生能力的检测HUVECs以5×10⁴/ml密度种细胞于96孔板,分6组,同上所述,分别加入PBS和以上5组的MVs。应用划痕实验、Transwell小室侵袭实验、小管形成实验检测各组HUVECs血管新生的能力。6.QT-PCR检测MVs中血管新生因子内容物采用QT-PCR方法检测以上5组MM MVs中VEGF、IL-6和bFGF的mRNA表达水平。7.QT-PCR和ELISA检测HUVECs的血管新生因子水平HUVECs以5 x 10⁴/ml密度接种并分成6组,同上所述,分别加入PBS和5种不同的MM MVs（10μg/ml）。共培养24h后,QT-PCR检测不同组HUVECs中VEGF、IL-6和bFGF的mRNA表达水平,ELISA检测HUVECs培养上清中这些因子的蛋白表达水平。8.HUVEC细胞NF-κB通路的检测同上,HUVECs随机分成6组,分别与以上5种10μg/mL的MM MVs或PBS共培养24h后,分别应用QT-PCR、Western、免疫荧光染色检测NF-κB的水平。结果:1 MM MVs的定量MM细胞有很多的MVs脱落,硼替佐米组（B10-MV和B100-MV）的MVs量显著高于对照组,但来那度胺对MVs的分泌无显著影响。2 MM MVs对HUVECs增殖的影响用CCK8法检测细胞增殖。与对照组（PBS）相比,正常MVs显著促进HUVECs增殖,但药物处理的MVs组（包括硼替佐米和来那度胺）对HUVECs增殖无显著影响。3药物处理可显著降低MM MVs的VEGF、IL-6和bFGF的水平QT-PCR检测发现,与PBS组相比,硼替佐米和来那度胺组MVs中VEGF、IL-6和bFGF的基因表达水平均显著降低,但硼替佐米和来那度胺组之间无差异。4 MM MVs的内化改变了HUVECs血管生成因子的水平。分别采用QT-PCR和ELISA方法检测VEGF、IL-6和bFGF在HUVECs及条件培养基中的表达水平。结果显示,正常培养细胞的MVs（NMVs）中上述细胞因子均显著高于PBS组。所有加药培养细胞的MVs（DMVs）中VEGF、IL-6和bFGF表达水平均显著低于NMVs组。5 NMVs促进HUVECs的迁移、侵袭和小管形成,但硼替佐米和来那度胺使MM MVs的促血管新生活性下降。5.1划痕实验检测细胞迁移NMVs处理24小时后,HUVECs向划痕区域的迁移显著改善。与NMVs组相比,DMVs组的细胞迁移活性整体降低,虽然B100-MV和L1-MV组没有达到统计学差异。5.2 Transwell侵袭实验检测侵袭能力NMVs促进细胞侵袭,与NMVs组相比,4个DMVs组的细胞侵袭能力显著下降。5.3小管形成实验检测血管生成活性6h时,NMVs组与对照组相比虽有增加趋势,但未达到统计学意义,但所有DMVs组与NMVs组相比小管形成均显著减少。在24h,与对照组相比,NMVs显著促进HUVECs的小管形成;与NMVs组相比,所有DMVs组的小管形成能力均显著下降。6 NMVs增加HUVECs中NF-κB的激活,但硼替佐米和来那度胺抑制了MM MVs对HUVECs NF-κB的激活。6.1用QT-PCR检测NF-κB p65亚基的表达与对照组相比,NMVs组NF-κB p65的表达增加,所有DMVs组与NMVs组相比均显著降低。6.2 western blot方法检测HUVECs总蛋白中p65和核蛋白中p-p65的表达水平p-p65蛋白表达水平:NMVs组显著高于对照组;与NMVs组相比,所有DMVs组显著降低。然而,p65水平在各组之间没有显著差异。6.3免疫荧光显微镜检测p65的核内转运p65核内易位在NMVs组中显著增加,而在DMVs组中显著减少。小结:1.硼替佐米可诱导骨髓瘤细胞释放的更多的MVs,但来那度胺并未显著改变MVs数量。2.硼替佐米和来那度胺处理可降低MM MVs的VEGF、IL-6和bFGF的水平,使得MM MVs的血管新生因子含量减少。3.硼替佐米和来那度胺处理可抑制MM MVs的促血管新生能力。4.硼替佐米和来那度胺处理可抑制MM MVs促进HUVECs中NF-κB活化的作用,并减少了HUVECs促血管生成因子的分泌。5.硼替佐米和来那度胺可能通过减少MM MVs中血管新生因子含量和抑制HUVECs中NF-κB活化来抑制血管新生,从而为MM的抗血管新生治疗提供另一种机制。第三部分多发性骨髓瘤患者循环微泡的检测及与疾病相关性的临床研究目的:通过量化多发性骨髓瘤（MM）患者与正常对照的各种循环MVs的水平,并通过测定血清中的血管新生因子,探讨MM患者恶性浆细胞来源的MVs的水平以及与其他表型MVs及血管新生因子之间的相关性及其与疾病严重程度、临床特征、药物治疗的关系,以探讨其可能作为新的诊断、病情评估指标及治疗靶点的潜在用途。方法:选取2015年3月至2017年9月河北医科大学第二医院和河北大学附属医院血液科住院的多发性骨髓瘤患者共66例,包括初治患者39例,缓解期患者27例,21例非肿瘤患者作为对照组,缓解期患者根据是否应用硼替佐米分为两组:无硼替佐米组（无BTZ组）共15例,以硼替佐米为基础的治疗方案组（BTZ组）共12例。收集病例资料,详细记录临床信息并分析统计;差异离心法提取MM患者外周血的MVs,透射电镜下观察MVs形态,流式细胞术计数MVs并检测MVs的表型,ELISA测定患者血清中VEGF、IL-6及bFGF水平。结果:1.MM患者外周血的MVs同样为直径<1.0um的完整囊泡2.MM患者的外周血中CD38⁺CD138⁺MVs的比例显著高于正常对照组,而且初治组患者高于缓解组。相对于初治组患者,流式细胞术计数发现缓解期患者的CD38⁺CD138⁺MVs数量显著下降,随着缓解程度的加深进一步地下降,而疾病进展后,又似有升高趋势。3.MM患者的CD41⁺MVs和CD45⁺MVs均高于正常对照组,但初治组和缓解组患者之间无显著差异。相比之下,初治组CD105⁺MVs平均比例明显高于缓解组和对照组,缓解组和正常对照组无明显差异。CD38⁺CD138⁺MVs与CD41⁺MVs、CD45⁺MVs及CD105⁺MVs均呈正相关。4.与正常对照组相比,初治MM患者的VEGF、IL-6、bFGF均显著升高,随着骨髓瘤治疗的缓解,缓解期患者的这三个血管新生因子水平均显著下降。CD38⁺CD138⁺MVs与VEGF、IL-6以及bFGF水平均呈正相关。5.初治MM患者外周血的CD38⁺CD138⁺MVs数量与患者的分期、骨损害、骨髓浆细胞比例还有β₂-MG水平呈显著正相关。6.缓解期的MM患者分成无BTZ组和BTZ组,bFGF水平在BTZ组显著下降,但两组的CD38⁺CD138⁺MVs、CD41⁺MVs、CD45⁺MVs、CD105⁺MVs的数量和VEGF、IL-6的水平均无显著差异。小结:1.MM患者恶性浆细胞来源的MVs（CD38⁺CD138⁺MVs）的数量可能与肿瘤负荷相关,初诊时显著升高,治疗后随肿瘤负荷降低而下降。CD38⁺CD138⁺MVs可作为多发性骨髓瘤诊断和评估病情的一个指标。2.CD38⁺CD138⁺MVs水平与CD41⁺MVs、CD45⁺MVs、CD105⁺MVs以及VEGF、IL-6、bFGF的水平正相关,CD38⁺CD138⁺MVs可能与MM患者血管新生有关,可成为多发性骨髓瘤治疗干预的一个有力靶点。3.CD38⁺CD138⁺MVs水平与MM患者分期、骨损害、骨髓浆细胞比例以及β₂-MG呈正相关,提示CD38⁺CD138⁺MVs可能是反映多发性骨髓瘤患者肿瘤负荷和预后的一个指标。结论:1.通过差异离心法能提取到完整的MVs,MVs携带起源细胞的标志。MM MVs能被HUVECs摄取,可促进HUVECs增殖及血管新生。2.硼替佐米可诱导骨髓瘤细胞释放的更多的MVs。硼替佐米和来那度胺可能通过减少MM MVs中血管新生因子含量和抑制HUVECs中NF-κB活化来抑制血管新生。3.MM患者循环CD38⁺CD138⁺MVs的数量可能与肿瘤负荷及血管新生相关,可作为MM诊断和评估病情、反映预后的一个指标以及治疗干预的一个靶点。