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骨形态发生蛋白15(bone morphogenetic protein，BMP15)属于转化生长因子β(TGFβ)超家族成员，定位于X染色体，由卵母细胞特异表达，以旁分泌方式调节颗粒细胞功能，并参与调节印泡生长的微环境，对早期卵巢卵泡的生长发育起着重要的调控作用。本试验以BMP15基因为候选基因，采用PCR-SSCP技术，对湖羊和中国美利奴共348个个体进行多态性检测，分析绵羊BMP15基因第一、二外显子的遗传多样性，并分析了各多态位点与绵羊繁殖性状之间的关系，探讨调控绵羊繁殖力的基因位点，为湖羊的选育和保种提供理论基础。同时，利用生物信息学进一步分析了突变位点对BMP15基因的氨基酸组成、蛋白二级结构的影响。此外，黄体期短期限饲抑制绵羊卵泡发育，本试验探究了湖羊黄体期短期限饲对BMP巧信号通路相关基因表达的影响。研究结果如下:
1.湖羊BMP15基因的SNP检测
以3只高繁殖力湖羊和3只低繁殖力湖羊的基因组为模板，分别扩增BMP15基因外显子1和外显子2片段，共挑选36个阳性克隆测序。运用DNAMAN5.2版软件进行序列比对分析，在两个外显子上共发现7个突变点。针对突变区域，设计4对引物，进行PCR一SSCP检测验证，引物3和引物5扩增片段存在多态，表明绵羊群体存在此位点突变。对不同基因型个体克隆测序，结果表明引物3扩增片段存在外显子1第31、32、33碱基CTT缺失突变，国外已有报道;引物5扩增片段存在外显子2第430碱基处T→C突变，为首次在绵羊品种中发现。
2.绵羊BMP15基因的生物信息学分析
运用生物信息学软件对BMP巧基因的氨基酸组成、信号肤分析、亚细胞定位以及蛋白二级结构进行预测，并比对野生型和突变型蛋白二级结构的差异。外显子1中亮氛酸缺失及外显子2中亮氨酸→脯氨酸的替换，均略引起BMP15蛋白二级结构元件比例的改变。
3.绵羊BMP15基因的多态性与湖羊产羔数的相关性研究
基于已检测到的两处突变位点，本研究采用PCR-SSCP技术检测BMP15在湖羊和中国美利奴羊中的SNP及其与湖羊产羔数的相关性。结果:外显子1的31∧CTT在2个绵羊品种中均只检测到AA和AB基因型，等位基因A为优势等位基因，湖羊AA基因型比AB基因型平均产羔数多0.12只，但差异不显著(P＞0.05);外显子2的T43OC在2个绵羊品种中均检测到CC、CD和DD三种基因型，等位基因C为优势等位基因，两个品种间的基因频率分布差异极显著(P＜0.01)，不同基因型与湖羊产羔数无显著差异(P＞0.05);单倍型分析显示，AACC单倍型组合平均产羔数为2.607，但与其他单倍型相比差异不显著(P＞0.05)。结论:两个突变与湖羊产羔数不相关，但T43OC与不同绵羊品种的繁殖力相关。
4.黄体期短期限饲对湖羊BMP15信号通路基因表达的影响
本试验研究湖羊黄体期短期限饲对BMP15信号通路相关基因表达的影响。试验羊随机分成两组:1.5M组(n=5)和0.5M组(n=5)。同期发情结束后第6天分别按1.5M和0.5M饲喂，第12天屠宰。采用荧光定量PCR检测卵巢组织中BMP15信号通路各基因的表达水平，结果表明BMP15通路各基因mRNA的表达量在1.5M和0.5M组内均差异不显著(P＞0.05)，但与1.SM组相比，0.5M组Smad1、Smad4、BMPRIB和BMPRII基因mRNA的表达上调，其中BMPRII基因表达差异接近显著(P=0.082)，说明黄体期短期限饲抑制卵巢卵泡发育可能与BMP巧信号通路有关。
1.湖羊BMP15基因的SNP检测
以3只高繁殖力湖羊和3只低繁殖力湖羊的基因组为模板，分别扩增BMP15基因外显子1和外显子2片段，共挑选36个阳性克隆测序。运用DNAMAN5.2版软件进行序列比对分析，在两个外显子上共发现7个突变点。针对突变区域，设计4对引物，进行PCR一SSCP检测验证，引物3和引物5扩增片段存在多态，表明绵羊群体存在此位点突变。对不同基因型个体克隆测序，结果表明引物3扩增片段存在外显子1第31、32、33碱基CTT缺失突变，国外已有报道;引物5扩增片段存在外显子2第430碱基处T→C突变，为首次在绵羊品种中发现。
2.绵羊BMP15基因的生物信息学分析
运用生物信息学软件对BMP巧基因的氨基酸组成、信号肤分析、亚细胞定位以及蛋白二级结构进行预测，并比对野生型和突变型蛋白二级结构的差异。外显子1中亮氛酸缺失及外显子2中亮氨酸→脯氨酸的替换，均略引起BMP15蛋白二级结构元件比例的改变。
3.绵羊BMP15基因的多态性与湖羊产羔数的相关性研究
基于已检测到的两处突变位点，本研究采用PCR-SSCP技术检测BMP15在湖羊和中国美利奴羊中的SNP及其与湖羊产羔数的相关性。结果:外显子1的31∧CTT在2个绵羊品种中均只检测到AA和AB基因型，等位基因A为优势等位基因，湖羊AA基因型比AB基因型平均产羔数多0.12只，但差异不显著(P＞0.05);外显子2的T43OC在2个绵羊品种中均检测到CC、CD和DD三种基因型，等位基因C为优势等位基因，两个品种间的基因频率分布差异极显著(P＜0.01)，不同基因型与湖羊产羔数无显著差异(P＞0.05);单倍型分析显示，AACC单倍型组合平均产羔数为2.607，但与其他单倍型相比差异不显著(P＞0.05)。结论:两个突变与湖羊产羔数不相关，但T43OC与不同绵羊品种的繁殖力相关。
4.黄体期短期限饲对湖羊BMP15信号通路基因表达的影响
本试验研究湖羊黄体期短期限饲对BMP15信号通路相关基因表达的影响。试验羊随机分成两组:1.5M组(n=5)和0.5M组(n=5)。同期发情结束后第6天分别按1.5M和0.5M饲喂，第12天屠宰。采用荧光定量PCR检测卵巢组织中BMP15信号通路各基因的表达水平，结果表明BMP15通路各基因mRNA的表达量在1.5M和0.5M组内均差异不显著(P＞0.05)，但与1.SM组相比，0.5M组Smad1、Smad4、BMPRIB和BMPRII基因mRNA的表达上调，其中BMPRII基因表达差异接近显著(P=0.082)，说明黄体期短期限饲抑制卵巢卵泡发育可能与BMP巧信号通路有关。