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研究背景：食管癌是一种恶性程度很高的肿瘤,在全球肿瘤相关的死亡率上排行第六。在2008年,全球有食管癌新增病例482,300例,死亡406,800例。由于食管癌在早期的时候症状不典型,大多数食管癌患者往往一经诊断就已经处于中晚期。由于缺少有效的治疗手段,食管癌的发病率和死亡率相当地接近。食管癌的长期预后非常地糟糕,整体的五年生存率低于10%。对致癌作用、肿瘤生长以及转移等信号通路的深入了解,或许能够给食管癌的治疗提供一个新的分子治疗靶点。细胞凋亡作为细胞程序化死亡的主要形式,首先在形态学上被认识到。细胞核和细胞质,包括线粒体,在细胞凋亡时会发生固缩,细胞内容物则被由浆膜围绕的凋亡小体包裹起来。凋亡小体表面发出的吞噬信号,使它能迅速被周围的吞噬细胞吞噬并被它们的溶酶体消化。肿瘤细胞逃避细胞凋亡的能力是人类癌症的一个重要特征,也是众多肿瘤治疗失败的一个重要原因。凋亡主要通过两条途径进行激活,包括外源性和内源性途径,前者是通过激活细胞表面的死亡受体,后者则是通过干扰线粒体膜的通透性。Bcl-2蛋白家族对于内源性细胞凋亡通路来说是一类重要调控因子。到目前为止,已经知道超过30种Bcl-2家族蛋白,包括抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL等)和促凋亡蛋白(Bak、Bax和BH3-only蛋白等)。值得注意的是,有研究表明Bcl-2家族成员在食管癌中存在异常表达的现象,例如Bax的表达下调、Bcl-2和Bcl-XL的过度表达。由于Bcl-2家族蛋白对调控细胞的死亡具有十分重要的作用,因此在食管癌的治疗上以抗凋亡的Bcl-2家族蛋白为靶点具有很大的吸引力。在最近几十年,出现了一系列新的BH3-only蛋白类似物,它们有望成为一类新的有效的抗肿瘤药物。在这些BH3-only蛋白类似物中,obatoclax (GX15-070)是一种吲哚二吡咯类化合物,它可以与目前已知的所有Bcl-2抗凋亡蛋白结合。obatoclax与BH3-only蛋白的作用类似,能够竞争性地与抗凋亡的Bcl-2家族蛋白形成的疏水性凹槽结合。尽管obatoclax对血液恶性肿瘤和实体瘤的治疗已进入I期和II期临床试验,但是其抗肿瘤作用的分子机制还不是非常的清楚。尽管有研究表明,obatoclax能够打断Bak和Mcl-1的连接,使得Bak从Mcl-1中解离出来,进一步引起细胞色素C的释放,最后导致细胞发生凋亡,但是也有研究表明obatoclax的细胞毒作用与Bax和Bak引起的凋亡作用无关,这就表明可能存在其它的作用靶点。虽然很多正在作为抗肿瘤药物来研究的化合物对细胞周期的众多环节具有作用,但是obatoclax对细胞活力的影响与细胞周期之间的关系仍然不清楚。尽管有研究表明,obatoclax能够诱导急性白血病细胞产生S期阻滞的作用,然而其确切的机制也是不清楚的。在本研究中,我们研究了obatoclax对人食管癌细胞活力的作用与细胞周期进程的关系。此外,我们还进一步探索了obatoclax对细胞周期进程的影响的作用机制。我们期望这个研究能给obatoclax的抗肿瘤机制带来新的视角。目的：研究Bcl-2抑制剂obatoclax抗人食管癌的活性,并在此基础上进一步阐明其抗癌机制。方法：1. CellTiter-Glo Luminescent法检测细胞活力不同浓度的BcI-2抑制剂obatoclax分别与人食管癌细胞(EC109、CaES-17和HKESC-1)共同孵育24h后停止培养,然后用CellTiter-Glo Luminescent法检测细胞活力。2.流式细胞仪检测细胞周期的分布1)不同浓度的Bcl-2抑制剂obatoclax分别与人食管癌细胞(EC109、CaES-17和HKESC-1)共同孵育24h后收集细胞；2) MAPK通路抑制剂(Erk通路抑制剂为U0126、p38通路抑制剂为SB203580、JNK通路抑制剂为JNK inhibitor Ⅱ)与obatoclax合用或者各自单独处理细胞24h后收集细胞；3)用小干扰RNA(siRNA)敲低Bak、Bax、p38、p21waf1/Cip1,接着用obatoclax处理人食管癌细胞(EC19、CaES-17和HKESC-1)24后收集细胞；4)以上收集的细胞用75%的乙醇固定,并置于4℃冰箱密封保存过夜。离心收集细胞,PBS洗1次,每管细胞加入500μL含PI (50μg/mL)及RNA酶(10μg/mL)的PBS溶液,细胞置于37℃避光孵育30min,后于1h内上样,最后用流式细胞仪检测细胞周期的分布。3.流式细胞仪检测细胞凋亡情况不同浓度的Bcl-2抑制剂obatoclax分别与人食管癌细胞(EC109、CaES-17和HKESC-1)共同孵育24h后停止培养,用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞,离心后细胞用PBS洗2次,再用FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit中的1×缓冲液100μL重悬细胞,加入FITC5μL,避光,室温放置15min。每管细胞中再分别加入400μL的1×缓冲液,充分混匀后于1h内上样,然后用流式细胞仪检测细胞的Annexin V阳性率。4. Western blotting检测G1/G0期相关蛋白以及MAPK通路蛋白的表达情况1)分别以3株食管癌细胞(EC109、CaES-17和HKESC-1)24h的IC50与细胞共同孵育0,1/4,1/2,1,3,6,12,24h,然后用蛋白裂解液裂解细胞并收集蛋白,最后用western blotting检测p21waf1/Cip1、p-p21waf1/cip1、CDK2、 CDK4、CDK6、p38、p-p38、Erk、p-Erk、JNK、p-JNK等的表达情况。2) MAPK通路抑制剂与obatoclax合用或者各自单独处理细胞24h后用蛋白裂解液裂解细胞并收集蛋白,最后用western blotting检测21waf1/Cip1的表达情况。5.小干扰RNA (siRNA)实验用设计合成好的特异性靶向的小干扰RNA来敲低人食管癌细胞中的Bak、Bax、p38和p21waf1/Cip1等蛋白的表达。按照说明书,用HiPerFect转染试剂将设计合成好的Bak、Bax、p38和21waf1/Cip1的siRNA转染人食管癌细胞,转染48h后用obatoclax处理细胞。6.统计学分析数据分析和作图均是由GraphPad Prism5.0(数据分析和作图软件)提供,所有数据采用SPSS13.0软件包进行统计分析处理。结果：1.利用CellTiter-Glo Luminescent法来测定obatoclax对食管癌细胞活力的影响。Obatoclax对人食管癌细胞EC109、CaES-17,以及HKESC-1都具有显著地抗肿瘤效果,它们24h的IC50分别是1.0±0.1μM,0.3±0.1μM,0.9±0.2μM。2. Obatoclax能够引起人食管癌细胞EC109、CaES-17,以及HKESC-1产生显著地G1/G0周期阻滞作用。分别以三株细胞1/4、1/2和1倍IC50浓度的obatoclax处理细胞,obatoclax能够显著性地将细胞周期阻滞在G1/G0期,即使在1/4ICso浓度下obatoclax处理组与空白组都具有显著性地差异,并随着药物浓度增大,G1/G0期的比例也逐渐增大,呈正相关变化。3. Obatoclax处理细胞24h不能够引起人食管癌细胞EC109、CaES-17,以及HKESC-1产生凋亡。分别以三株细胞1/2和1倍IC50浓度的obatoclax处理细胞,obatoclax不能引起细胞发生凋亡。从流式细胞仪检测Annexin V阳性细胞的结果来看,处理组和空白组不具有显著性差异。与此同时,用western blotting的方法并没有检测到obatoclax处理组发生PARP的切割,然而用顺铂作为阳性药的处理组却出现了明显地PARP切割。4. Obatoclax引起人食管癌细胞EC109、CaES-17,以及HKESC-1产生的G1/G0周期阻滞作用与Bak、Bax无关。用小干扰RNA的手段敲低了Bcl-2受死样相关分子Bak和Bax的表达,发现对obatoclax引起的G1/G0周期阻滞作用无明显影响,这也表明obatoclax诱导细胞产生GI/G0周期阻滞的作用与Bak、Bax无关。5. Obatoclax通过p38/p21waf1/Cip1信号通路将人食管癌细胞EC109、CaES-17,以及HKESC-1阻滞在G1/G0期。从蛋白分子水平发现,obatoclax(?)够引起细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制剂21waf1/Cip1的显著性上调,并随着药物处理时间的延长,21waf1/Cip1的表达逐渐上升,呈时间依赖性。与此同时,并不改变p-p21waf1/Cip1、CDK2、CDK4以及CDK6蛋白的表达。机制研究发现,用小干扰RNA的手段敲低p21waf1/Cip1的表达后,obatoclax在食管癌细胞上(EC109、CaES-17和HKESC-1)引起的G1/G0周期阻滞作用能够显著地被削弱。这些结果表明,21waf1/Cip1与obatoclax引起人食管癌细胞发生周期阻滞的作用有关。虽然obatoclax能够引起丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路中Erk、p38以及JNK通路的激活,用三条通路的抑制剂与obatoclax共同处理细胞,发现只有p38通路抑制剂能够逆转obatoclax引起的G1/G0周期阻滞作用,其余两条通路则无明显影响。与此同时,从western blotting的角度来看的话,抑制了p38通路后可以完全地阻断obatoclax引起的p21waf1/Cip1的上调,然而抑制Erkl/2或者JNK却不能削弱obatoclax引起的p21waf1/Cip1的上调。此外,用小干扰RNA的手段敲低p38的表达后,obatoclax引起G1/G0周期阻滞的作用被完全阻断。这些结果表明,p38与obatoclax引起人食管癌细胞发生周期阻滞的作用有关,主要是参与了CDK抑制剂21waf1/Cip1的调控。结论：1. Obatoclax能够显著地降低人食管癌细胞的活力。2. Obatoclax能够显著性地将人食管癌细胞阻滞在G1/G0期,但不能引起细胞发生凋亡,同时obatoclax引起的G1/G0周期阻滞作用与Bak和Bax无关。3. Obatoclax通过激活p38信号通路显著性地上调细胞周期依赖性激酶抑制剂p21waf1/Cip1蛋白的表达将细胞阻滞在GI/G0期,从而降低了人食管癌细胞的活力。