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目的：⑴通过吉姆萨染色、吖啶橙染色法观察临床疑似感染附红细胞体病的患者，以此建立起人附红细胞体病的显微镜检诊断技术。⑵比对鼠、猫、狗、猪、牛、羊的附红细胞体16S RNA基因的同源性设计引物，设计出两对特异性引物。⑶通过兔红细胞泥与人附红细胞体混合体外增殖培养，观察感染后结果。同时，利用不同剂量人工接种成体家兔，观察感染后家兔进行分析，期望为人附红细胞体病防治积累更多的资料。
方法：采集在内蒙古医科大附属医院就诊的疑似被感染附红细胞体病原体的42患者血液、已确诊感染附红细胞体的32例患者血液、非感染者10名的血液，通过吉姆萨染色、吖啶橙染色观察疑似患者红细胞形态及其病原体生长、繁殖状况，结合临床症状，来初步确诊是否感染附红细胞体病病原体。然后设计两对特异性引物，一对为同源性较高区域特异性引物，另外一对为包括可变区和稳定区的特异性引物。最后通过PCR技术，以疑似患者血液提取DNA为模板，来扩增特异性序列，以此来诊断是否被感染附红细胞体病。另外，利用DNAMAN生物信息学软件对Gene Bank已经公布的五种物种16S rRNA基因序列进行同源性比较和系统发育树建立。将胎牛血清和RPMI-1640以40％比例混合并添加肌苷作为体外增殖人附红细胞体的基础培养基，以兔红细胞泥作为培养寄生载体，接种人附红细胞体感染的红细胞，置于5％ CO2、37℃培养。
结果：①通过吉姆萨染色，显示红细胞形态大小不一，多见球形状态的红细胞，且点状和杆状很少。附红细胞体寄生在红细胞表面，也有的游离在血浆之中。同样，通过吖啶橙染色，得到的结果与吉姆萨染色结果类似，红细胞形态多是不规则形状，附红细胞体呈寄附状态。②设计两对特异性引物，分别是1号引物Forward:TACGGGAAGCAGCAGTAG(GA)GGAAT和Reverse:TTCAC(T)CCCGATATAGCTGACACG(A)GG;2号引物Forward:GTGGG(T)AGCAAATGGGATTAGA和Reverse:TAGTTTGACGGGCGGTGTGTACAA。通过提取血液基因组，以基因组DNA为模板，特异性引物克隆16S rRNA基因片段，以此来确诊。③根据Gene Bank公布的鼠、猫、猪、牛、羊的附红细胞体16S rRNA基因序列，进行序列比对并构建其系统发育树，为研究人类感染的附红细胞体16SrRNA基因提供进化理论支持。④人附红细胞体体外增殖培养，每隔24h换培养液、传代，可连续传代40次以上，维持感染率90％以上;接种兔红细胞，36h后感染率可达90％以上，且持续到96h，此后少量细胞开始出现溶血。
结论：⑴吉姆萨和吖啶橙染色依然是临床上确诊附红细胞体病的有效检测手段，但是为了确诊患者，避免造成贻误治疗时机，还需做进一步的诊断。本研究设计了有效的特异性引物两对，初步建立了实验室PCR诊断附红细胞体病的体系。⑵从分析不同物种感染的附红细胞体16S rRNA基因序列，构建了发育进化图谱。⑶通过与兔红细胞泥混合培养，初步建立起体外培养体系。