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研究目的:蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是人类严重的颅脑血管疾病,占脑卒中发病率的5%,具有高致死率和致残率,给社会和家庭带来沉重的经济负担和精神压力。在临床SAH患者预后过程中,脑实质内常新增微小梗塞灶,部分微小梗塞灶离破裂动脉瘤位置较远(甚至是发生在对侧大脑半球),这一临床现象引起了研究的关注。从SAH病理机制角度分析,动脉瘤破裂以后蛛网膜下腔的血液沿类淋巴系统弥散至全脑;在弥散的过程中,周细胞包绕微血管外径接受来自血液及其代谢产物持续、直接的损伤。SAH后脑脊液中富含血液代谢产物、炎症因子、氧化应激产物等致纤因素,长期存在(刺激)使得周细胞发生纤维化改变成为了可能,进一步导致微循环功能障碍。因此,我们猜想:在蛛网膜下腔的血液及其代谢产物沿类淋巴系统弥散全脑的过程中,致纤因素通过直接或者间接方式引起调控微循环的周细胞发生纤维样改变,导致微小梗塞灶形成。本研究拟在小鼠体内、体外SAH模型中检测周细胞的形态学、分子学变化,并利用体外共培养系统进一步证明周细胞纤维化变对神经损伤修复过程的影响;探讨SAH后周细胞纤维化变过程中可能存在的PDGFRβ/MAPK信号通路的调控机制,为以周细胞纤维化变为治疗靶点缓解SAH后早期脑损伤(early brain injury,EBI)、改善预后打下坚实基础。研究方法:利用C57BL/6小鼠制作视交叉池SAH体内模型,采用小鼠原代神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞、周细胞建立单细胞系统或共培养系统SAH模型。第一部分:从成年小鼠脑组织中提取原代周细胞,采用分阶段培养的方式传代至第5-7代,通过流式细胞仪和免疫荧光染色鉴定周细胞的纯度;利用鉴定合格的周细胞建立体外SAH模型,并检测形态学变化、周细胞标记物和肌成纤维细胞标记物的变化。第二部分:通过western blot、real time-PCR和免疫荧光染色技术检测血小板源性生长因子受体β(platelet-derived growth factor receptor-beta,PDGFRβ)在体内SAH前后的变化;利用特异性抑制剂SL327分别在小鼠体内、体外周细胞、体外周细胞-神经元共培养系统SAH模型中明确PDGFRβ/ERK信号通路对周细胞-肌成纤维细胞转分化作用及其参与的神经功能损伤修复的调控意义。第三部分:采用ELISA技术检测体外周细胞培养基中分泌型前蛋白转化酶枯草杆菌转化酶/可馨型9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)的变化;通过western blot、real time-PCR和免疫荧光染色技术等检测脂质受体高亲和力蛋白PCSK9在体内、体外周细胞SAH后的变化;利用特异性抑制剂SB203580分别在小鼠体内、体外周细胞SAH模型中检测PDGFRβ/P38信号通路对PCSK9合成分泌的调控作用;使用慢病毒技术在SAH后下调小鼠脑内PCSK9的蛋白水平,对比干预前后神经损伤、炎症反应的变化;在体外小胶质细胞、体外星形胶质细胞-神经元共培养系统SAH模型中检测PCSK9重组蛋白对神经保护和炎症反应的影响。研究结果:第一部分:通过分阶段培养方式传代至第5-7代,可见免疫荧光染色明显表达周细胞标记物CD13和PDGFRβ,流式细胞仪双标鉴定提示周细胞双阳性率达89.9%;原代周细胞SAH模型建立后可见周细胞形态明显皱缩、胞浆中肌纤维排列杂乱,平滑肌收缩蛋白和胶原蛋白表达明显增多。第二部分:免疫荧光染色结果提示PDGFRβ蛋白主要定位于神经元、星形胶质细胞、周细胞,SAH后神经元中PDGFRβ染色明显减弱,星形胶质细胞和周细胞中PDGFRβ染色明显增强,PDGFRβ的蛋白含量和mRNA水平在SAH后明显提升,提示PDGFRβ通路在SAH后激活;在体内SAH中,SL327可明显抑制PDGFRβ/ERK信号通路及其下游的平滑肌蛋白、胶原蛋白的表达,伴随着神经再生能力、成熟神经元棘突完整性、小鼠记忆功能明显提升;在共培养系统中抑制周细胞的PDGFRβ/ERK信号通路,神经元凋亡、细胞毒性和轴突损伤在SAH后明显缓解。第三部分:小鼠体内、体外周细胞SAH后PCSK9的蛋白含量、mRNA水平均明显提高,PCSK9的细胞定位主要在神经元、周细胞,分泌型PCSK9在体外周细胞SAH后明显提高;在体内SAH中,SB203580可明显抑制PDGFRβ/P38信号通路及其下游的PCSK9的表达;慢病毒处理在体内SAH后可明显下调PCSK9的蛋白表达,伴随神经元棘突完整性提高、炎症反应缓解;体外星形胶质细胞-神经元共培养系统中PCSK9重组蛋白在SAH后可显著抑制星形胶质细胞对神经元的保护作用;体外小胶质细胞SAH后PCSK9重组蛋白可显著增加炎症因子(IL-6、IL-1β和TNFα)的释放量。研究结论:微血管壁上的周细胞在SAH后可向肌成纤维细胞转分化,以PDGFRβ/ERK信号通路为治疗靶点可抑制转分化作用、缓解神经损伤和改善记忆功能;在转分化过程中脂质受体高亲和力蛋白PCSK9含量明显提高,以PDGFRβ/P38通路为治疗靶点可有效缓解PCSK9参与的神经损伤和炎症反应。综上所述,以PDGFRβ/MAPK信号通路为治疗靶点可有效缓解SAH后周细胞-肌成纤维细胞转分化作用及其参与的神经损伤,改善预后。