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背景与目的：在我国，结核病是引起胸积液的第一大病因，肿瘤是引起胸积液的第二大病因。胸积液腺苷脱氨酶(ADA)活性测定已成为I临床上结核性胸积液诊断和鉴别诊断普遍使用的指标，尤其是用于结核和肿瘤性胸积液的鉴别诊断。
ADA作用是催化腺苷脱氨转化为次黄苷，ADA有2种同工酶，即ADAi和ADA2。ADA2是由位于22号染色体的CECR1编码。ADA1和ADA2的不同生化特性，使它们能在不同的环境下发挥作用。ADA的作用底物腺苷是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、一磷酸腺苷(AMP)、脱氧腺苷等物质的重要中间体。腺苷还是一种重要的内源性信号转导分子，产生多种生理及病理作用。在生理状态下，细胞内外的腺苷浓度很低。在各种应激情况下，腺苷浓度大幅度上升，从而激活各种腺苷受体发挥对免疫应答及炎性反应的调控作用。而ADA通过催化腺苷，调节腺苷浓度起作用。结核性胸积液ADA升高的原因还不明确，一种观点认为是淋巴细胞分泌ADA所致；另一种观点认为是由单核巨噬细胞分泌ADA2所致。为了进一步弄清结核性胸积液中ADA2来源，ADA2在结核性胸积液和肿瘤性胸积液胸膜病理组织的分布，并了解结核性和肿瘤性胸积液中总ADA、ADAi和ADA2的活性。本研究分别从体内、体外来研究ADA、ADAi和ADA2的分布情况，进行以下实验研究：1、收集结核性胸积液和肿瘤性胸积液患者的胸积液，检测胸积液中总ADA、ADA1和ADA2活性，以了解结核性胸积液和肿瘤性胸积液中ADA同功酶的变化情况；2、体外研究用佛波酯(PMA)刺激THP-1细胞，建立单核巨噬细胞模型。然后观察经卡介苗刺激后各时段单核巨噬细胞培养上清液中总ADA、ADA1和ADA2活性的变化；3、应用CECR1(即ADA2)抗体进行结核性胸积液和肿瘤性胸积液的胸膜组织的ADA2免疫组化检测，进一步了解ADA2的细胞来源和CECR1抗体在结核病理的应用。通过本研究，将进一步了解结核性胸积液ADA同功酶活性变化情况及其产生原因，尤其是有助于了解ADA2是否来自于单核巨噬细胞。在此基础上，将有助于加深对单核巨噬细胞抗结核分技杆菌感染机制的认识和拓宽ADA检测尤其是ADA2检测的应用。
材料和方法
1.结核性胸积液和肿瘤性胸积液的ADA同功酶活性检测
收集广州市胸科医院2009年3月至2009年8月确诊结核性胸积液患者39例和肿瘤性胸积液患者30例，按照检测试剂盒的说明并根据是否加入ADA1抑制剂(EHNA)，测定胸积液总ADA活性和ADA2活性，ADA1=总ADA-ADA2，计算ADA2占总ADA的比例。
统计学方法
实验数据以x±s表示，如数据服从正态分布，用t检验。如不服从正态分布，两组数据之间的比较应用Wrilcoxon两样本秩和检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2.卡介苗对单核巨噬细胞腺苷脱氨酶同功酶活性的影响
用佛波酯刺激THP-1细胞，建立单核巨噬细胞模型。然后测定经空白(0mg/ml)和低浓度(0.033mg/ml)、中浓度(0.05mg/ml)、高浓度(0.1mg/m1)4个卡介苗刺激剂量来刺激的0小时、6小时、12小时、24小时的细胞培养上清液的ADA、ADA1和ADA2活性。
3.结核性胸积液和肿瘤性胸积液病理组织的ADA2免疫组化检测
选取经病理确诊的结核性胸积液和肿瘤性胸积液病理组织，应用CECR1(即ADA2)抗体，用免疫组化方法检测ADA2在结核性胸积液和肿瘤性胸积液病理组织中的分布。以巨噬细胞表面标志CD68抗体代替ADA2抗体作免疫组化为阳性对照，以PBS代替ADA2抗体作免疫组化为阴性对照。
结果
1.结核性胸积液组ADA活性(44.6±23.7)比恶性胸积液组(15.7±14.4)明显升高，Wilcoxonw值是643，p<0.01；结核性胸积液组ADA2活性(31.1±17.4)明显高于恶性胸积液组(10.5±9.2)，Wilcoxonw值是657，p<0.01。结核性胸积液组ADA活性明显升高主要是由于ADA2活性升高引起，ADA2占总ADA69.5％。总ADA诊断结核性胸积液的敏感性和特异性分别为79.5％和90.0％。ADA2诊断结核性胸积液的敏感性和特异性分别为79.5％和93.3％。
2.卡介苗作用24小时后，高浓度、中浓度、低浓度卡介苗组的总ADA和ADA2活性和空白对照组相比，均有明显升高趋势。高浓度卡介苗组的总ADA与空白对照组相比为3.5/1.3，高浓度卡介苗组的ADA2活性和空白对照组相比为2.5/1.0。总ADA升高，以ADA2升高为主，ADA2占其组总ADA71.4％。中浓度卡介苗组的总ADA与空白对照组相比为2.8/1.3，中浓度卡介苗组的ADA2活性和空白对照组相比为2.0/1.0。总ADA升高，以ADA2升高为主，ADA2占其组总ADA71％。低浓度卡介苗组的总ADA与空白对照组相比为2.6/1.3，低浓度卡介苗组的ADA2活性和空白对照组相比为1.8/1.0。总ADA升高，以ADA2升高为主，ADA2占其组总ADA69％。
3.结核性胸积液病理组织ADA2免疫组化显示结核结节的朗罕巨细胞和它周围的上皮样细胞被深染，它们的胞浆和胞膜有棕黄色沉着，ADA2免疫组化的细胞染色与以巨噬细胞表面标志CD68抗体的免疫组化相似。小部分淋巴细胞浅染，大部分淋巴细胞不染色。胸膜转移性腺癌的ADA2免疫组化显示只见小量吞噬细胞浅染。结核性胸积液和肿瘤性胸积液病理组织ADA2免疫组化阴性对照(PBS代替ADA2抗体)图片无棕黄色沉着。
结论
1、结核性胸积液总ADA活性升高，是以ADA2升高为主，检测胸积液总ADA和ADA2有利于结核性胸积液和肿瘤性胸积液的鉴别诊断。
2、巨噬细胞受卡介苗刺激后，分泌ADA2增加。
3、结核性胸积液的ADA2升高主要是来自于单核巨噬细胞。
ADA作用是催化腺苷脱氨转化为次黄苷，ADA有2种同工酶，即ADAi和ADA2。ADA2是由位于22号染色体的CECR1编码。ADA1和ADA2的不同生化特性，使它们能在不同的环境下发挥作用。ADA的作用底物腺苷是用于合成三磷酸腺苷(ATP)、一磷酸腺苷(AMP)、脱氧腺苷等物质的重要中间体。腺苷还是一种重要的内源性信号转导分子，产生多种生理及病理作用。在生理状态下，细胞内外的腺苷浓度很低。在各种应激情况下，腺苷浓度大幅度上升，从而激活各种腺苷受体发挥对免疫应答及炎性反应的调控作用。而ADA通过催化腺苷，调节腺苷浓度起作用。结核性胸积液ADA升高的原因还不明确，一种观点认为是淋巴细胞分泌ADA所致；另一种观点认为是由单核巨噬细胞分泌ADA2所致。为了进一步弄清结核性胸积液中ADA2来源，ADA2在结核性胸积液和肿瘤性胸积液胸膜病理组织的分布，并了解结核性和肿瘤性胸积液中总ADA、ADAi和ADA2的活性。本研究分别从体内、体外来研究ADA、ADAi和ADA2的分布情况，进行以下实验研究：1、收集结核性胸积液和肿瘤性胸积液患者的胸积液，检测胸积液中总ADA、ADA1和ADA2活性，以了解结核性胸积液和肿瘤性胸积液中ADA同功酶的变化情况；2、体外研究用佛波酯(PMA)刺激THP-1细胞，建立单核巨噬细胞模型。然后观察经卡介苗刺激后各时段单核巨噬细胞培养上清液中总ADA、ADA1和ADA2活性的变化；3、应用CECR1(即ADA2)抗体进行结核性胸积液和肿瘤性胸积液的胸膜组织的ADA2免疫组化检测，进一步了解ADA2的细胞来源和CECR1抗体在结核病理的应用。通过本研究，将进一步了解结核性胸积液ADA同功酶活性变化情况及其产生原因，尤其是有助于了解ADA2是否来自于单核巨噬细胞。在此基础上，将有助于加深对单核巨噬细胞抗结核分技杆菌感染机制的认识和拓宽ADA检测尤其是ADA2检测的应用。
材料和方法
1.结核性胸积液和肿瘤性胸积液的ADA同功酶活性检测
收集广州市胸科医院2009年3月至2009年8月确诊结核性胸积液患者39例和肿瘤性胸积液患者30例，按照检测试剂盒的说明并根据是否加入ADA1抑制剂(EHNA)，测定胸积液总ADA活性和ADA2活性，ADA1=总ADA-ADA2，计算ADA2占总ADA的比例。
统计学方法
实验数据以x±s表示，如数据服从正态分布，用t检验。如不服从正态分布，两组数据之间的比较应用Wrilcoxon两样本秩和检验，以p<0.05为差异有统计学意义。
2.卡介苗对单核巨噬细胞腺苷脱氨酶同功酶活性的影响
用佛波酯刺激THP-1细胞，建立单核巨噬细胞模型。然后测定经空白(0mg/ml)和低浓度(0.033mg/ml)、中浓度(0.05mg/ml)、高浓度(0.1mg/m1)4个卡介苗刺激剂量来刺激的0小时、6小时、12小时、24小时的细胞培养上清液的ADA、ADA1和ADA2活性。
3.结核性胸积液和肿瘤性胸积液病理组织的ADA2免疫组化检测
选取经病理确诊的结核性胸积液和肿瘤性胸积液病理组织，应用CECR1(即ADA2)抗体，用免疫组化方法检测ADA2在结核性胸积液和肿瘤性胸积液病理组织中的分布。以巨噬细胞表面标志CD68抗体代替ADA2抗体作免疫组化为阳性对照，以PBS代替ADA2抗体作免疫组化为阴性对照。
结果
1.结核性胸积液组ADA活性(44.6±23.7)比恶性胸积液组(15.7±14.4)明显升高，Wilcoxonw值是643，p<0.01；结核性胸积液组ADA2活性(31.1±17.4)明显高于恶性胸积液组(10.5±9.2)，Wilcoxonw值是657，p<0.01。结核性胸积液组ADA活性明显升高主要是由于ADA2活性升高引起，ADA2占总ADA69.5％。总ADA诊断结核性胸积液的敏感性和特异性分别为79.5％和90.0％。ADA2诊断结核性胸积液的敏感性和特异性分别为79.5％和93.3％。
2.卡介苗作用24小时后，高浓度、中浓度、低浓度卡介苗组的总ADA和ADA2活性和空白对照组相比，均有明显升高趋势。高浓度卡介苗组的总ADA与空白对照组相比为3.5/1.3，高浓度卡介苗组的ADA2活性和空白对照组相比为2.5/1.0。总ADA升高，以ADA2升高为主，ADA2占其组总ADA71.4％。中浓度卡介苗组的总ADA与空白对照组相比为2.8/1.3，中浓度卡介苗组的ADA2活性和空白对照组相比为2.0/1.0。总ADA升高，以ADA2升高为主，ADA2占其组总ADA71％。低浓度卡介苗组的总ADA与空白对照组相比为2.6/1.3，低浓度卡介苗组的ADA2活性和空白对照组相比为1.8/1.0。总ADA升高，以ADA2升高为主，ADA2占其组总ADA69％。
3.结核性胸积液病理组织ADA2免疫组化显示结核结节的朗罕巨细胞和它周围的上皮样细胞被深染，它们的胞浆和胞膜有棕黄色沉着，ADA2免疫组化的细胞染色与以巨噬细胞表面标志CD68抗体的免疫组化相似。小部分淋巴细胞浅染，大部分淋巴细胞不染色。胸膜转移性腺癌的ADA2免疫组化显示只见小量吞噬细胞浅染。结核性胸积液和肿瘤性胸积液病理组织ADA2免疫组化阴性对照(PBS代替ADA2抗体)图片无棕黄色沉着。
结论
1、结核性胸积液总ADA活性升高，是以ADA2升高为主，检测胸积液总ADA和ADA2有利于结核性胸积液和肿瘤性胸积液的鉴别诊断。
2、巨噬细胞受卡介苗刺激后，分泌ADA2增加。
3、结核性胸积液的ADA2升高主要是来自于单核巨噬细胞。