论文部分内容阅读
乳腺癌是女性中最常见的恶性癌症类型,致死率排名第二。乳腺癌分激素阳性（雌激素阳性或孕激素阳性）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2,Her2）阳性和三阴性三类,其中Her2阳性乳腺癌约占总患者的25%,是恶性程度最高的一种乳腺癌亚型,具有复发率高、预后差等特点。常规的肿瘤治疗手段主要包括手术、化疗、放疗等。手术切除和化疗通常产生较大的伤害。而传统化疗使用的药物通常是一些细胞毒分子如铂类药物、烷化剂及紫杉醇类等,因缺乏靶向性,进入体内具有全身毒性,出现对正常细胞的杀伤。曲妥珠单抗是1998年由FDA批准的靶向Her2的单克隆抗体,它的应用显著改善了早期Her2阳性乳腺癌患者的预后,是目前治疗该类乳腺癌的一线靶向药物。然而曲妥珠单抗单药治疗Her2阳性晚期乳腺癌有效率仅为20%-30%,联合化疗治疗的有效率最高仅60%。由于内吞能力的不足,产生一定的耐药性和心脏毒性等一系列不良反应,导致至少70%的Her2阳性乳腺癌患者出现了疾病进展。因此如何能够提高靶向药物的内吞能力,已成为开发新的Her2药物的方向。细胞穿膜肽（Cell penetrating peptides,CPPs）是一类可以穿透生物膜并将各种外源物质递送到细胞内的短肽,这种有效的转运系统不受细胞类型的影响且具有较低的细胞毒性。根据其理化性质可以分为阳离子穿膜肽、两亲性穿膜肽和疏水性穿膜肽三类。用穿膜肽增加抗体药物的体内递送是解决抗体药物耐药性,增加抗体药物效果的优选方案。单链抗体（single chain antibody,sc Fv）相对于全抗体积小,具有良好的组织渗透能力,能在血液中快速清除,因此近年来在抗胞内抗原领域得到广泛的应用。BP16是从用于植物保护的天蚕素-蜂毒素杂种库中筛选出来的阳离子穿膜肽。S413是一种嵌合肽,包括一个13个氨基酸的衍生自线性聚阳离子肽皮肤肽素的穿膜序列,和一个衍生自SV40-T抗原的核定位序列,能够渗透到完整的细胞中并在细胞核内积累。MAP是继发性两亲性穿膜肽,它包括亲水部分和疏水部分两部分。本论文用穿膜肽BP16、MAP和S413偶联本实验室筛选的曲妥珠单抗的单链抗体,获得重组蛋白CPP-sc Fv,结果表明能够增加sc Fv的穿膜效果,可增加对Her2阳性乳腺癌细胞凋亡。并通过对重组蛋白CPP-sc Fv的设计、表达、功能验证及分子动力学分析三种穿膜肽偶联单链抗体后穿膜效率差异等方面的研究,发现MAP（两亲性CPP）与磷脂膜作用强烈,易形成较稳定的结构,与sc Fv偶联,有效的提高了抗肿瘤能力。具体研究结果如下:1.通过overlap PCR构建了重组蛋白BP16-sc Fv、S413-sc Fv、MAP-sc Fv表达载体并在大肠杆菌（B21（DE3））大量表达。通过镍亲和层析得到的重组蛋白纯度均在90%以上,满足后续生物学实验验证的要求。2.用MST检测sc Fv、BP16-sc Fv、S413-sc Fv、MAP-sc Fv与Her2抗原的相互作用,发现穿膜肽的存在不影响sc Fv与Her2抗原的亲和性。通过检测重组蛋白的内吞发现,在Her2阳性乳腺癌中,sc Fv、CPP-sc Fv均有明显的内吞,说明sc Fv、CPP-sc Fv都是通过Her2特异性结合来结合细胞的。MAP-sc Fv内吞效果最显著,是sc Fv的三倍。通过MTT法和流式细胞仪检测重组蛋白的细胞毒性。结果表明与单独的sc Fv相比,CPP-sc Fv的细胞毒性更大,IC50值显著降低,诱导细胞凋亡的能力更强,其中MAP-sc Fv的效果更明显,其IC50值降低了7.7倍。3.通过分子动力学模拟分析,随着模拟时间的增加（2000ns的模拟）,MAP可以逐渐插入磷脂膜中,最终没入双层膜中,而S413和BP16只是吸附在膜表面,插入深度远不如MAP。三种穿膜肽与磷脂膜相互作用后,磷脂膜均有横向扩张、纵向压缩的趋势。其中,MAP趋势最显著,与磷脂膜作用最强烈,S413次之,BP16相对较差。4.通过计算分子同源建模所构建模型的总势能,发现MAP-sc Fv的总势能最低,结构更稳定,说明穿膜肽MAP偶联单链抗体后的重组蛋白结构更稳定。综上所述,本文制备的穿膜肽偶联抗体在体外具有良好的抗肿瘤效果,MAP为代表的两亲性穿膜肽将为开发新的Her2阳性乳腺癌靶向药物奠定了理论基础。