农标菌介导大豆胚尖转化体系的优化及Sporamin和Chitinase KDEL转化后代分析

• 作 者: 卢涛
• 机 构: 浙江大学
• 出 处: 浙江大学
• 发表日期: 2012年期
• 关键词: 大豆 农标菌 胚尖转化体系 农艺性状

大豆(Glycine max L.)是我国主要的粮食作物，也是食用油和植物蛋白质的主要来源。从1996年起，我国大豆进出口形势发生了根本性的逆转，成为大豆净进口国，其中绝大部分是转基因大豆及其产品。在耕地日益紧张，粮食安全问题日益凸显的情况下，发展转基因技术显得尤为重要。但目前我国大豆转基因技术存在转化效率低和实验重复性差的特点，如何提高大豆转化效率是转基因大豆产业化迫切需要解决的问题。本论文主要通过大豆基因型、农杆菌菌液浓度、农杆菌侵染方法、芽诱导阶段植物激素处理等因素优化大豆成熟胚尖为外植体的农杆菌介导转化体系;同时还研究了Sporamin和Chitinase KDEL大豆转基因后代的鉴定和分离以及转基因植株农艺性状和产量的分析。　　
以大豆成熟种子胚尖为外植体，以含有GUS报告基因和筛选标记bar基因的pTF102为载体，研究了不同基因型黑农37、中豆32、中黄10、中黄30、YC03-3和YC04-5六个大豆栽培品种对农杆菌介导的GUS瞬时表达率和芽诱导的影响，结果表明不同基因型表现为GUS瞬时表达率和芽诱导率最高的基因型为YC03-3;不同农杆菌菌液浓度（OD6500.4、0.6、0.8、1.0和1.2）侵染大豆胚尖外植体表明OD650为0.6-0.8共培养3d后GUS瞬时表达率最高;常规侵染与超声波辅助侵染相比，超声波辅助侵染有助于提高胚尖外植体的GUS瞬时表达率;不同植物生长激素（6-BA和IBA）浓度梯度组合与芽诱导密切相关，其中以0.4 mg/16-BA和0.04 mg/1 IBA组合丛生芽诱导率最高达72.33％;此外还初步探讨了胚尖外植体液体培养与固体培养对芽诱导的影响，液体培养比固体培养芽伸长得更快，有利于缩短转基因苗的再生周期。综上所述，优化后适于农杆菌介导大豆胚尖转化体系为以YC03-3大豆胚尖为外植体，采用OD650值0.6-0.8的农杆菌菌液以超声波辅助农杆菌法共侵染外植体30 min，光照共培养3天后转入含有6-BA0.4 mg/1和IBA0.04 mg·L-1的SI诱导培养基上诱导芽的再生，转入WPM培养基上诱导丛生芽的伸长，然后转入RM上诱导生根从而获得转基因苗。　　
比较了PCR法、bar试纸条法和草丁膦叶片涂抹法对大豆转sporamin和chitinase KDEL基因后代进行了鉴定，结果表明:三种方法鉴定T0和T1代转基因植株，如草丁膦叶片涂抹法为阳性植株则bar试纸条法和PCR法鉴定法也为阳性，反之亦然，因此采用135 mg/1草丁膦涂抹叶片方法可作为草丁膦筛选标记转基因大豆植株的大规模筛选。在得到的45株T0代阳性植株中只有4个独立的株系外源基因在T1代遗传，其中2个株系呈现3∶1的遗传分离比例符合孟德尔遗传分离比，在T2代转化植株中阳性植株为165株，占总株数的47.97％。此外研究了外源基因对转化后代生育期和农艺性状的影响，所得到的转基因后代与野生型相比，生育期和产量性状方面无显著性差异且都是可育的。