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目的:
(1)探讨褪黑素对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞增殖活性的影响及相关机制。
(2)探讨褪黑素对HXO-RB44细胞上清液诱导的ARPE-19细胞内VEGF表达的影响及相关机制。
(3)探讨褪黑素对视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞周期异常及细胞凋亡的影响及相关机制。
(4)探讨褪黑素对HXO-RB44细胞皮下移植瘤的生长抑制作用及其相关机制。
方法:
(1)利用细胞计数、MTT比色法，观察体外培养条件下，不同浓度的MLT对视网膜母细胞瘤增殖活性的影响；利用流式细胞仪测定浓度为10-5M的MLT干预不同时间(12h、24h、36h、48h)，以及不同浓度的MLT(10-6、10-5、10-4、10-3M)干预24h，HXO-RB44细胞内活性氧的表达情况。
(2)选取HXO-RB44细胞上清液，对体外培养的ARPE-19细胞进行干预，在HXO-RB44细胞上清液干预的ARPE-19细胞内分别加入10-9、10-7、10-5M的MLT，利用RT-PCR、免疫荧光细胞化学、Western-blot等方法，分别观察单独用上清液以及上清液+不同浓度的MLT干预后24h ARPE-19细胞内VEGF mRNA及蛋白质的表达情况。
(3)将体外培养的HXO-RB44细胞，分别利用不同浓度的MLT(10-10、10-9、10-8、10-7M)进行干预24h，或利用10-7M的MLT进行干预4h、8h、12h、24h。采用Hoechst荧光染色观察细胞核凋亡的形态学改变；流式细胞仪监测分析细胞周期与凋亡；RT-PCR、免疫细胞化学及Western-blot从mRNA及蛋白水平检测P21、P27基因的变化。
(4)建立50只RB裸鼠皮下移植瘤模型，随机分成5组：低、中、高浓度组分别按每只每次腹腔注射MLT 20mg/kg、40mg/kg、60mg/kg各2mL进行给药，阴性对照组注射等量生理盐水，阳性对照组每只每次腹腔注射等量VP-16(4mg/kg)，每天给药一次，共7次。观察各组裸鼠皮下移植瘤生长情况、裸鼠体重的变化。采用组织病理学检查，观察裸鼠移植瘤的形态学特征；采用免疫组化、Western-blot检测肿瘤细胞VEGF、ICAM-1的表达情况。
结果:
(1)浓度为10-7M以下的MLT不能抑制HXO-RB44细胞增殖，浓度为10-6以上的MLT能够显著抑制HXO-RB44细胞增殖，随着作用时间的延长，其抑制效率增强。10-5M的MLT干预后不同时间点，随着干预时间的延长，HXO-RB44细胞内ROS浓度逐渐升高；药物浓度介于10-6M与10-4M之间的MLT，随药物浓度的升高，HXO-RB44细胞内ROS的表达逐渐升高。
(2)HXO-RB44细胞上清液作用后4h、8h、12h、24h，ARPE-19细胞内VEGF mRNA及蛋白质呈高表达。不同浓度的MLT干预24小时，随MLT浓度的增大，各组ARPE-19细胞内VEGFmRNA及蛋白质的表达逐渐降低。
(3)不同浓度的褪黑素分别作用于培养的HXO-RB44细胞4h、8h、12h、24h后，细胞核固缩、核碎裂增多；药物干预后，G0/G1期细胞明显增多，S期细胞减少，G2/M期细胞相对增多；各组细胞核内均有P21、P27的表达。与阴性对照组相比，MLT干预组细胞内P21、P27mRNA及蛋白质的表达增强，并具有浓度及时间依赖性。
(4)40mg/kg、60mg/kg的MLT能明显抑制裸鼠移植瘤的生长。低、中、高剂量的MLT治疗组以及阳性对照组，裸鼠移植瘤抑瘤率分别为12.5％、27.89％、40.72％、44.52％。组织病理学检查发现治疗组及阳性对照组移植瘤内出血、坏死的程度明显高于阴性对照组；免疫组化、Western-blot结果显示治疗组VEGF、ICAM-1的表达明显低于对照组。
结论:
(1)10-6M以上浓度的MLT能够有效地抑制HXO-RB44细胞增殖，其抑制效率随药物浓度的升高和作用时间的延长而增强；MLT的抗细胞增殖作用可能与其诱导HXO-RB44细胞内的活性氧产生有关。
(2)HXO-RB44细胞上清液能促进ARPE-19细胞内VEGF的表达，随干预时间的延长，ARPE-19细胞内VEGF的表达增强。MLT能抑制HXO-RB44细胞上清液诱导的ARPE-19细胞内VEGF的高表达，随着药物浓度的增大，ARPE-19细胞内VEGF表达降低。
(3)褪黑素能够阻滞HXO-RB44细胞周期于G0/G1期，促进细胞内P21、P27mRNA及蛋白质的高表达并诱导HXO-RB44细胞凋亡。
(4)MLT对HXO-RB44细胞皮下移植瘤生长有抑制作用，MLT能抑制裸鼠移植瘤内VEGF、ICAM-1蛋白质的表达，其浓度与VEGF、ICAM-1蛋白质的表达呈高度负相关。