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脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)能催化水解、转酯、酯化等多种反应，在食品、化工、能源、医药等领域具有广泛应用。但是，脂肪酶的制备成本高这一瓶颈问题制约着其在工业上的应用。因此，构建脂肪酶高效工程菌和优化发酵工艺提高脂肪酶的表达量一直是脂肪酶研究的热点课题。耐热、耐碱性脂肪酶能应用于较苛刻反应条件，使用范围更广，具有巨大商业开发潜能，越来越受到学者的重视。疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase, TLL)属于碱性脂肪酶，具有良好的热稳定性、水解活性、转酯活性以及有机溶剂耐受性，广泛应用于油脂水解、有机合成、食品加工，药物拆分等领域。进一步提高TLL的表达量，降低其生产成本具有重要意义。毕赤酵母具有遗传操作简单、对蛋白的翻译后修饰、适合高密度发酵等优点，已被用来表达成百上千种重组蛋白。本文通过采用多种策略并举构建高效表达脂肪酶TLL的工程菌，并通过优化摇瓶培养和发酵罐高密度发酵条件，进一步提高了TLL的表达量。主要研究内容与结果摘要如下： （1）利用实验室保存的质粒DNA克隆了tll基因，构建了Mut+的重组工程菌GS115/9K-tll。通过抗性平板、酶活检测平板以及摇瓶发酵筛选到一株最高酶活力为1,950U/mL的GS115/9K-tll3＃克隆子。对其摇瓶培养单因素条件优化，酶活力提高了2.23倍，达到4,350U/mL，优化条件为：500mL的摇瓶起始装液量为20mL，诱导温度27℃，培养基起始pH7.0，每24 h甲醇添加量1.2％，接种量为4％，甲醇诱导144 h。重组目的蛋白经MALDI-TOF-TOF的蛋白质质谱分析，并通过肽段序列比对，确证表达的目的蛋白是TLL。 （2）分别构建了诱导型表达质粒pPICZαA-tll、pFZα-tll和组成型表达质粒pGAPZαA-tll。以重组工程菌GS115/9K-tll3＃为宿主细胞，二次电转化构建了3种双质粒表达重组工程菌。通过平板筛选和摇瓶发酵筛选得到3株高酶活力菌株GS115/9Ktll-ZαAtll40＃、GS115/9Ktll-FZαAtll46＃和GS115/9Ktll-GAPtll45＃，在摇瓶优化条件下最高酶活力分别达6,600U/mL、6,000U/mL、4,800U/mL，较GS115/9K-tll3＃分别提高了52％、38％和10％，总蛋白含量也分别提高了100％，40％和29％。利用荧光定量PCR技术确定了重组菌GS115/9Ktll-ZαAtll40＃、GS115/9Ktll-FZαAtll46＃、GS115/9Ktll-GAPtll45＃和GS115/9K-tll3＃的tll基因拷贝数分别为7、5、3和2。 （3）克隆了P. pastoris的分子伴侣基因Ero和Sec61，并构建胞内表达质粒pPICZA-Ero和pPICZA-Sec61。利用实验室保存的pPICZX-Bip和pPICZX-PDI以及构建成功的pPICZA-Ero和pPICZA-Sec61分别电转化GS115/9K-tll3＃感受态细胞，通过多重筛选，在摇瓶培养水平获得四株产酶效果最好的重组工程菌GS115/9Ktll-ZXBip20＃、GS115/9Ktll-ZXPDI13＃、GS115/9Ktll-ZASec618＃和GS115/9Ktll-ZAEro28＃，最高酶活力分别达5,700U/mL，5,200U/mL，5,400U/mL和4,900U/mL。经过EndoH糖苷内切酶处理的TLL的分子量为32kDa，较之前减小了2~3 kDa，证实P.pastoris中表达的TLL存在一定的糖基化修饰。 （4）3L发酵罐高密度发酵中，重组工程菌GS115/9K-tll3＃在甲醇/山梨醇混合补料时，TLL最高酶活力为27,000U/mL，较甲醇单独补料时提高了38.5％，最高总蛋白含量达到4.02g/L，较单独补料时提高了22.5％。GS115/9Ktll-ZαAtll40＃在3L发酵罐中，在诱导阶段pH为5.5时最高酶活力和总蛋白含量分别达到40,000U/mL和5.27g/L，比pH6.3时分别提高了29％和7.8％。10L发酵罐中GS115/9Ktll-ZαAtll40＃的最高酶活力达64,000U/mL，总蛋白含量为7.6g/L，酶活生产率为667 U/(mLh)， TLL酶的比活力达到了8,421U/mg。