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玉米黏虫（Mythimna separata）是属于鳞翅目夜蛾科的农业害虫，主要危害玉米等粮食作物。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是研究基因功能的重要方法，而基于RNAi技术的寄主诱导的基因沉默（Host-induced gene silencing，HIGS）为培育抗虫转基因植物开辟了新途径。大多数鳞翅目昆虫的RNAi效率较低，因此提高RNAi效率是基于RNAi的鳞翅目害虫控制措施的关键所在。MsChi1和MsChi2是玉米黏虫中编码几丁质酶（Chitinase）的两个基因。本研究中，首先获得了过表达hpMsChi1和hpMsChi2的转基因水稻，评价了其对受试昆虫的HIGS效应，并利用小RNA高通量测序进一步分析了HIGS触发的siRNA的类型和特征。另一方面，本研究建立了一种基于人工microRNA（Artificial microRNA，amiRNA）的PTA（Polycistronic-tRNA-amiRNA）表达系统，将其稳定转化并获得了同时干扰玉米黏虫多个基因的转基因玉米。比较分析了PTA和hpRNA技术诱导的RNAi效率。最后，对MsAGO2、MsDcr2和MsSID1等RNAi机制核心蛋白进行了生化特性分析，为玉米黏虫的RNAi机制提供了理论基础。
主要研究结果如下：
1.玉米黏虫中的HIGS效应及其siRNA特征分析
本研究首先获得了稳定表达MsChi1和MsChi2基因hpRNA表达盒的转基因水稻hpMsChi1-Ox和hpMsChi2-Ox。通过靶基因表达量、死亡率统计、体重和体长的测量来评估取食转基因水稻后玉米黏虫的RNAi效应。结果表明，hpMsChi2-Ox水稻比hpMsChi1-Ox水稻对玉米黏虫产生更显著的RNAi效应。利用小RNA高通量测序技术分析了取食转基因水稻后的MsChi2基因特异性的siRNA的丰度和特征。在hpMsChi2-Ox水稻和取食hpMsChi2-Ox水稻的玉米黏虫肠道中均有效积累了MsChi2特异的siRNA，其20-24nt的siRNA具有以下几个特点：（1）主要分布在导入区；（2）以22nt类型siRNA居多；（3）具有正义链偏好性。
2.MsChi2的表达特征及其编码蛋白的生物活性分析
表达谱分析结果显示，MsChi2基因主要在玉米黏虫体壁和肠道组织中高表达，这可能与玉米黏虫蜕皮时几丁质的降解有关。几丁质酶活性实验显示，MsChi2蛋白具有水解几丁质的活性。为了验证几丁质酶在玉米黏虫幼虫生长发育中的作用，将几丁质酶抑制剂（Psammaplin A）与人工饲料混合饲喂玉米黏虫，同时以dsChi2与人工饲料混合饲喂作为平行对照。实验结果表明，与dsChi2饲喂效果相似，几丁质酶抑制剂对玉米黏虫表现出明显的杀虫活性。
3.PTA表达系统提高玉米黏虫靶基因的沉默效率
amiRNA是根据miRNA的表达特点和作用原理设计的一种新型RNAi技术。本研究首次引入了针对多个靶基因进行干扰的基于amiRNA的PTA表达系统。构建了针对玉米黏虫MsChi2、MsActin和MsREase等基因的PTA表达盒，并获得了稳定表达PTA的转基因玉米PTA-Ox。与hpMsChi2-Ox水稻相比，取食PTA-Ox玉米的玉米黏虫表现出更高且更持久的RNAi效应，同时能够同时沉默三个靶基因。取食PTA-Ox玉米的玉米黏虫在不同生长阶段和不同器官中表现出更明显的发育异常的表型。推测这种发育异常可能与MsChi2基因的系统性沉默有关。上述结果证明了建立的多靶基因沉默系统的有效性。
4.玉米黏虫RNAi核心基因的功能验证
为了进一步探讨玉米黏虫RNAi机制，对MsAGO2、MsDcr2和MsSID1等RNAi机制蛋白进行了生化活性分析。在凝胶迁移实验中，MsAGO2蛋白通过浓度依赖性方式结合并阻滞了32P标记的ssRNA迁移率。MsSID1也以剂量依赖的方式与32P标记的dsRNA的特异性结合，而这种ssRNA/dsRNA结合活性被未标记的竞争物所消除。MsDcr2蛋白将dsRNA切割成大小为20-24nt的siRNAs，而对照组GST蛋白没有表现出这种活性。上述RNAi机制核心蛋白的生化活性可能是玉米黏虫体内存在系统性RNAi的主要原因。综上所述，通过对siRNA特征和RNAi机制成分的分析，为玉米黏虫RNAi机制的存在提供了有力的理论基础，并且PTA系统为提高鳞翅目害虫的RNAi防治具有重要研究意义。
主要研究结果如下：
1.玉米黏虫中的HIGS效应及其siRNA特征分析
本研究首先获得了稳定表达MsChi1和MsChi2基因hpRNA表达盒的转基因水稻hpMsChi1-Ox和hpMsChi2-Ox。通过靶基因表达量、死亡率统计、体重和体长的测量来评估取食转基因水稻后玉米黏虫的RNAi效应。结果表明，hpMsChi2-Ox水稻比hpMsChi1-Ox水稻对玉米黏虫产生更显著的RNAi效应。利用小RNA高通量测序技术分析了取食转基因水稻后的MsChi2基因特异性的siRNA的丰度和特征。在hpMsChi2-Ox水稻和取食hpMsChi2-Ox水稻的玉米黏虫肠道中均有效积累了MsChi2特异的siRNA，其20-24nt的siRNA具有以下几个特点：（1）主要分布在导入区；（2）以22nt类型siRNA居多；（3）具有正义链偏好性。
2.MsChi2的表达特征及其编码蛋白的生物活性分析
表达谱分析结果显示，MsChi2基因主要在玉米黏虫体壁和肠道组织中高表达，这可能与玉米黏虫蜕皮时几丁质的降解有关。几丁质酶活性实验显示，MsChi2蛋白具有水解几丁质的活性。为了验证几丁质酶在玉米黏虫幼虫生长发育中的作用，将几丁质酶抑制剂（Psammaplin A）与人工饲料混合饲喂玉米黏虫，同时以dsChi2与人工饲料混合饲喂作为平行对照。实验结果表明，与dsChi2饲喂效果相似，几丁质酶抑制剂对玉米黏虫表现出明显的杀虫活性。
3.PTA表达系统提高玉米黏虫靶基因的沉默效率
amiRNA是根据miRNA的表达特点和作用原理设计的一种新型RNAi技术。本研究首次引入了针对多个靶基因进行干扰的基于amiRNA的PTA表达系统。构建了针对玉米黏虫MsChi2、MsActin和MsREase等基因的PTA表达盒，并获得了稳定表达PTA的转基因玉米PTA-Ox。与hpMsChi2-Ox水稻相比，取食PTA-Ox玉米的玉米黏虫表现出更高且更持久的RNAi效应，同时能够同时沉默三个靶基因。取食PTA-Ox玉米的玉米黏虫在不同生长阶段和不同器官中表现出更明显的发育异常的表型。推测这种发育异常可能与MsChi2基因的系统性沉默有关。上述结果证明了建立的多靶基因沉默系统的有效性。
4.玉米黏虫RNAi核心基因的功能验证
为了进一步探讨玉米黏虫RNAi机制，对MsAGO2、MsDcr2和MsSID1等RNAi机制蛋白进行了生化活性分析。在凝胶迁移实验中，MsAGO2蛋白通过浓度依赖性方式结合并阻滞了32P标记的ssRNA迁移率。MsSID1也以剂量依赖的方式与32P标记的dsRNA的特异性结合，而这种ssRNA/dsRNA结合活性被未标记的竞争物所消除。MsDcr2蛋白将dsRNA切割成大小为20-24nt的siRNAs，而对照组GST蛋白没有表现出这种活性。上述RNAi机制核心蛋白的生化活性可能是玉米黏虫体内存在系统性RNAi的主要原因。综上所述，通过对siRNA特征和RNAi机制成分的分析，为玉米黏虫RNAi机制的存在提供了有力的理论基础，并且PTA系统为提高鳞翅目害虫的RNAi防治具有重要研究意义。