【摘 要】
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本文实现了小鼠肝脏羧酸酯酶的基因克隆表达,并对重组酶的酶学性质和降解作用进行研究。提取小鼠肝脏总RNA经反转录PCR克隆羧酸酯酶基因(ceslf),与pUCm-T载体连接,构建克隆载
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本文实现了小鼠肝脏羧酸酯酶的基因克隆表达,并对重组酶的酶学性质和降解作用进行研究。提取小鼠肝脏总RNA经反转录PCR克隆羧酸酯酶基因(ceslf),与pUCm-T载体连接,构建克隆载体pUCm-T-ceslfo测序正确后,将ceslf亚克隆至表达载体pET-32a连接,构建重组表达质粒pET-32a-ceslf,转化到宿主菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示出分子质量约为77KD的特异性条带,但主要以包涵体形式存在。优化表达条件,确定最优条件为：pH6.5,20℃培养,转接量3:200,IPTG终浓度0.6mM,诱导8h。采用Ni柱对表达产物进行纯化,纯化后的可溶性蛋白酶比活为55.37U/mg,纯化回收率为47.8%。分别以α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯作为底物测定重组羧酸酯酶的Km值分别为：0.06125mM和0.1334mM,确定最适底物为α-乙酸萘酯。重组酶最适温度为27℃,最适pH在6.0到8.0之间。利用重组酶对农药进行降解实验,经HPLC检测发现对西维因、呋喃丹、甲基对硫磷及联苯菊酯等具有降解作用,为环境中农药残留的降解奠定了基础。
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