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脂肪酶是一类能催化水解长链三酰甘油脂的酶,是目前最重要的工业酶之一。随着酶生物技术的迅速发展,微生物脂肪酶已成为全世界热门研究的课题。目前,微生物脂肪酶的应用范围已经由最初的食品加工、洗涤、制革行业扩展到化妆品、生物柴油、医药、环境等众多工业和科研领域上。
本文从富含油脂的样品中筛选到一株产脂肪酶的真菌HB-03,并对其进行了形态学和分子生物学鉴定;对该菌株的产酶条件进行了优化;对脂肪酶进行了分离纯化,同时对其酶学性质做了初步的研究。
(1)来源于长沙各地富含油脂的样品经富集培养后,采用平板水解圈法进行初筛,得到18株可在以橄榄油为唯一碳源的油脂同化培养基上生长且形成明显水解圈的菌株,对这些株菌进行复筛,获得一株产酶活力相对较高的菌株HB-03。
(2)利用形态学和分子生物学手段对该菌株进行了鉴定,通过对其菌落特征、个体形态的观察和18S rDNA序列分析,最终确定该菌株为泡盛曲霉(Aspergillus awamori)。
(3)通过对HB-03菌株的培养条件及初始产酶培养进行优化,发现了HB-03菌株的在以1％的橄榄油为诱导物,0.5％的蔗糖为碳源,2％的蛋白胨和0.5％的酵母粉为复合有机氮源,0.1％(NH4)2SO4为无机氮源,pH为7.0的培养基中,于30℃,180 rpm的摇床培养36 h,可达最大酶产量—(45.9±2.3)U/mL。
(4)Aspergillus awamori HB-03胞外脂肪酶经90％硫酸铵沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤纯化,纯化倍数和回收率分别为10.6和18.84％,经p-NPP比色法测得该酶的比活为1862.2 U/mg。SDS-PAGE显示该脂肪酶分子量约为68 kDa。
(5)对纯化的脂肪酶进行酶学性质研究发现,纯化酶的最适作用pH和最适作用温度分别为8.5和40℃,该酶具有一定的热稳定性,在pH7.0-9.0范围内稳定性也较好;Cu2+,Fe3+和Mg2+在浓度为1mmol/L,时就可以抑制酶的活性,其中Cu2+对脂肪酶活性的抑制作用最大;CTAB和SDS强烈抑制纯化酶的活性,而EDTA对其影响非常微弱;纯化脂肪酶对底物p-NPP酶动力学常数Km值和Vmax分别是0.13 mmol/L和60.6 mmol/L/min。
综上所述,分离自长沙各地富含油脂的样品的Aspergillusawamori HB-03是一株碱性脂肪酶的高产菌株;对分离纯化自该菌株的碱性脂肪酶的酶学性质研究表明,该酶具有很好的应用前景。