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亚细胞蛋白质组学(Subcellular proteomics)的研究不但能够提供蛋白质的亚细胞定位信息，而且通过对特定细胞器和蛋白质复合物的蛋白质组成的研究对于理解它们的结构和功能都具有非常重要的意义。然而，由于各个亚细胞器的复杂性和许多蛋白质在细胞中的多定位特征，亚细胞蛋白质组学的研究面临着非常重要的两个问题:一是如何解决亚细胞器之间交叉污染问题;另一个是如何定位那些在细胞中具有多定位蛋白质的问题。本论文的第一部分我们主要研究怎样解决这两个问题。为此，我们建立了梯度富集亚细胞器(Stepwise-enriched organellefractionation，SEOF)结合非标记定量(Label-free)的方法。首先，通过亚细胞分级(Subcellular fractionation)的方法得到不同纯度的细胞核相关组分，然后将每个蛋白质在质谱实验中所鉴定到的肽段数(Peptide hits)作为定量依据，在经过统计学处理后，应用聚类分析的方法来描述不同蛋白质在这四个组分的变化趋势，并发现细胞核相关蛋白质的特异性的变化趋势。在我们的实验中，发现261个蛋白质展示了特异性的核蛋白量变趋势。其中三个蛋白质被选择采用体外转染的方法进一步验证它们的亚细胞定位情况。一个名为儿茶酚胺氧位甲基转移酶的蛋白质(Catechol-O-methyltransferase，COMT)，在Swiss-Prot数据库中被注释为细胞质和内质网蛋白，但是在我们的实验中却发现它体现出了明显的细胞核定位特征，经过进一步的免疫荧光检验，验证了它具有细胞核和细胞质的多定位的特征。我们又将这种梯度富集亚细胞器结合非标记定量的方法与目前常用的减法蛋白质组学方法和标记定量蛋白质组学方法进行了比较，实验证明了这种方法具备通量高，花费少和易于操作的优点。总之，这种结合了非标记定量和梯度富集亚细胞器组分的方法可以被认为是研究亚细胞蛋白质组学的强有力的方法，并值得广泛应用。 在第一部分的工作中我们发现了许多多定位的蛋白质，它们的多定位特征与信号转导分子的特征相符合。因此，本论文的第二部分我们希望可以通过亚细胞蛋白质组学的方法来研究那些与信号转导相关的多定位蛋白质，尝试描述他们随着信号分子的刺激在时间和空间上的动态变化，阐述它们在信号转导过程中发挥的作用。TNF-α/NF-κB信号通路在细胞生命活动的许多方面都发挥着重要的作用，例如细胞调亡，细胞分化，器官移殖，自身免疫，炎症反应等。在我们的工作中，采用了稳定同位素氨基酸的体内标记(Stable isotope labeling by amino acidsin cell culture，SILAC)结合亚细胞分级的策略来研究在TNF-α/NF-κB信号通路中细胞核相关蛋白质在时间和空间上的动态变化。通过高精度的质谱分析定量和严谨的数据分析，描述了在信号通路中动态变化的547个细胞核相关蛋白的变化趋势。根据KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库的功能注释，进一步分析了这种量变趋势与它们功能分类之间的关系。根据我们的工作，发现了许多与TNF-α/NF-κB信号通路密切相关的蛋白质，并且定量的描述了这些蛋白质在信号通路中的变化，分析了它们的功能特征。尤其是发现通过TNF-α的刺激，FANCD2（Fanconi anemia family protein2）在细胞核内持续地积累。并且通过western blotting和免疫荧光的方法进一步确认了我们的结果。这也暗示了FANCD2可能通过在细胞核内的聚集参与TNF-α/NF-κB信号通路的转导。总之，通过将亚细胞蛋白质组学和定量蛋白质组学的方法相结合，我们不但探讨了在TNF-α/NF-κB信号通路中细胞核相关蛋白质在时间和空间上的动态变化，而且为以后更加深入研究信号通路的组成和动态变化提供了新的策略。 综上所述，我们发展完善了高通量，大规模的亚细胞蛋白质组学研究方法，使其不但能够更好地解决亚细胞器之间的交叉污染问题，而且可以比较有效的发现并定位那些在细胞中具有多定位的蛋白质。我们进一步将亚细胞蛋白质组学的方法引入到TNF-α/NF-κB信号转导通路的研究中，发现细胞核相关蛋白质在时间和空间上的各种动态变化趋势。并且定量的描述了许多未知的TNF-α/NF-κB信号通路相关蛋白质动态变化。实践证明这一研究方法在未来的生物学研究中具有非常广阔的应用前景，为进一步的研究工作提供了全新的认知视角和研究手段。